[發明專利]與鰭藻毒素-1特異性結合的適配體及其應用

有效

• 申請號: 202010099204.0
• 申請日: 2020-02-18
• 公開（公告）號: CN111349631B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發明（設計）人: 李真;胡波;王睿哲;周蓉;張曉娟;焦炳華;王梁華
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍海軍軍醫大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;G01N33/53;A61K31/7088;A61P39/02;C02F1/58;C02F101/34
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 趙青

本發明涉及生物醫藥工程技術領域，提供了與鰭藻毒素?1特異性結合的適配體及其應用。適配體的序列通式為：5’?GAGGCAGCACTTCACACGAT?Nsubgt;27/subgt;?CTGCGTAATGACTGTAGTGATG?3’；其中，N為A、T、G、C四種脫氧核糖核苷酸堿基中的任意一個，Nsubgt;27/subgt;代表長度為27bp的隨機序列。優選為如SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.6中任一條所示的序列，最優選為如SEQ?ID?NO.7～SEQ?ID?NO.10中任一條所示的序列，可以制備成適配體傳感器或檢測試劑，并將其應用于海水體樣品中DTX?1的檢測，還可以為預防或治療DTX?1中毒藥物的制備以及水體或水產品中DTX?1的去除奠定基礎。

技術領域

本發明涉及生物醫藥工程技術領域，具體涉及一條基于磁珠SELEX技術篩選獲得的與鰭藻毒素-1特異性結合的高親和力適配體，可用于臨床樣本中鰭藻毒素-1的快速檢測診斷和水體、食品中鰭藻毒素-1的監測。

背景技術

腹瀉型貝類毒素(Nodularin-R，DSTs)是一種全球分布最廣的海洋毒素。研究表明，DSTs不僅會導致惡心、嘔吐、腹瀉等消化道癥狀，而且還會促進腫瘤的發生，其毒性機理為抑制多種絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(PP)的活性，主要是PP1，PP2A，PP2B。自1978年起，研究者們共發現了三種腹瀉型貝類毒素，其中，鰭藻毒素-1(DTX-1)的毒性和致癌能力最強，也是在貝類體內沉積率最高的。人們主要因飲用被污染的水和誤食被污染的水產品而中毒，中毒癥狀包括惡心、嘔吐和腹瀉等，目前臨床尚無特效解毒劑。國內外衛生組織都將飲用水中DTX-1的最高含量規定為1μg/L。近些年來，一些被認定為“無DST”的海域也相繼發現了腹瀉型貝類毒素的存在，水產相關產業每年為此蒙受大量經濟損失。因此，亟需建立一種準確、靈敏的DTX-1檢測方法，以便更好的監控水體和水產品中DTX-1的水平，進而保障人們和水生生物的安全。

目前，常用的DTX-1的檢測方法主要分為三大類，即生物分析法、物理化學分析法和免疫化學法。其中，小鼠生物法(MBA)是檢測DTX-1最傳統的生物分析方法。然而，該方法不僅成本高、特異度低、重現性差，而且還存在倫理道德問題。化學分析法，如高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜質譜聯用(LC-MS)等也逐漸完善，其中液相色譜質譜聯用技術已經被歐盟確定為首要的檢測方法。然而，該方法需要進行復雜的樣品前處理過程，相關儀器設備昂貴，對技術人員有較高的技術要求。免疫化學法并未出現針對DTX-1的試劑盒，雖然OA的試劑盒已在實驗室中雖然已經進行廣泛應用，但是由于其缺乏特異性、步驟繁瑣，難以滿足海洋毒素的實時檢測。因此，亟需建立一種快速、靈敏的新型檢測方法。

近年來，生物傳感器檢測法因能克服傳統檢測方法的眾多缺點而備受研究者們的關注。生物傳感器的核心部件是分子識別元件，抗體是一種發展完善且備受關注的分子識別元件，但是，抗體不僅價格昂貴，容易變性，還會出現批次間的差異。因此，需要尋找一種新的分子識別元件。

在1990年，Tuerk和Gold首次通過指數富集的配基系統進化技術(SystematicEvolution?ofLigands?by?Exponential?Enrichment，SELEX)，成功篩選到了具有高親和力、強特異性的T4?DNA聚合酶核酸適配體。核酸適配體，即具有功能的單鏈寡核苷酸，包括ssDNA和RNA，能夠形成發夾、假結、i-motif和G-四鏈體等空間結構，并通過分子間的相互作用，如疏水作用、范德華力和氫鍵等特異性識別并結合靶分子。作為一種新型分子識別元件，適配體與抗體相似，但優于抗體。例如，適配體能夠識別多種靶標，如蛋白質、氨基酸以及金屬離子等，甚至細胞和病毒；適配體能夠與多種基團連接，修飾方便；適配體化學性質穩定，不容易變性；適配體可以直接化學合成，成本低廉。

目前，已經有很多學者將適配體應用于海洋生物毒素檢測領域，并與生物傳感器平臺(如電化學、熒光技術和表面等離子共振等)結合，研發了許多快速、新穎的檢測方法。然而，還沒有關于DTX-1適配體的相關報道。

發明內容