[發(fā)明專利]一種氨基酸消旋酶及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010098912.2
• 申請(qǐng)日: 2020-02-18
• 公開（公告）號(hào): CN111321192B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭仁朝;盧夏鋒;鄭裕國(guó)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P41/00
• 分類號(hào): C12P41/00;C12P13/06;C12P13/12;C12N9/90
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 韓聰

本發(fā)明公開了一種氨基酸消旋酶及其在催化氨基酸消旋中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述氨基酸消旋酶為氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽Ⅰ或與SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有至少70％同一性且具有催化氨基酸消旋功能的多肽Ⅱ，所述氨基酸消旋酶對(duì)Leu、Met等多種氨基酸異構(gòu)體具有消旋活性，且具有熱穩(wěn)定性，可將其應(yīng)用到酶催化L?Leu/D?Leu、L?Met/D?Met的消旋化，對(duì)于實(shí)現(xiàn)氨基酸對(duì)映體的相互轉(zhuǎn)化具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種嗜熱氨基酸消旋酶及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

除甘氨酸外，自然界常見的19種氨基酸均含有α-碳，具有L-型和D-型兩種對(duì)映異構(gòu)體。盡管D-氨基酸不是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元，但許多植物、動(dòng)物、微生物都含有D-氨基酸，具有重要生理功能。如D-氨基酸是組成細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖骨架、磷壁酸和聚-γ-谷氨酸等的結(jié)構(gòu)單元；一些D-氨基酸可作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝，如D-Leu在特定環(huán)境下可引起細(xì)胞膜的解體；含有D-天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸等D-型氨基酸的多肽，因具有抗菌活性而應(yīng)用于臨床等。

D-氨基酸在食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。如在食品領(lǐng)域，D-氨基酸構(gòu)成的二肽或者短肽是高甜度、安全、無(wú)熱量的甜味劑；在化妝品領(lǐng)域，D-氨基酸被應(yīng)用于保濕劑、護(hù)發(fā)劑和染發(fā)劑等；在醫(yī)藥領(lǐng)域，D-氨基酸及其衍生物是合成抗菌、抗病毒藥物和殺蟲劑的重要中間體。

細(xì)胞內(nèi)D-氨基酸的合成主要有兩種方法。一是氨基酸消旋酶催化L-氨基酸的構(gòu)象反轉(zhuǎn)，合成外消旋體(DL-氨基酸)，必須經(jīng)過(guò)手性分離才能得到光學(xué)純的D-氨基酸；二是D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶催化氨基轉(zhuǎn)移至α-酮酸生成相應(yīng)的D-氨基酸，但該反應(yīng)需要D-氨基供體。因此，將氨基酸消旋酶與D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶級(jí)聯(lián)是高效合成D-氨基酸的重要方法。如Bae等利用Bacillus sp.SK-1谷氨酸消旋酶將L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為DL-谷氨酸作為D-氨基供體，再通過(guò)級(jí)聯(lián)Bacillus sp.SK-1D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶將D-谷氨酸的氨基轉(zhuǎn)移給苯丙酮酸，生成產(chǎn)物D-苯丙氨酸和副產(chǎn)物α-酮戊二酸(J.Mol.Catal.B:Enzym,2002,12,85-92)。

目前已報(bào)道的氨基酸消旋酶多來(lái)源于中溫微生物，且底物譜較窄，如丙氨酸消旋酶、谷氨酸消旋酶、絲氨酸消旋酶和天冬氨酸消旋酶等。因此，開發(fā)具有較廣底物譜、熱穩(wěn)定的氨基酸消旋酶對(duì)于氨基酸對(duì)映體的相互轉(zhuǎn)化，尤其是D-氨基酸合成具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種底物譜廣且熱穩(wěn)定的氨基酸消旋酶。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)在NCBI中被假設(shè)為aspartate aminotransferase familyprotein的多肽(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，其實(shí)際功能為氨基酸消旋酶，故將其命名為嗜熱氨基酸消旋酶(TkAAR)。

本發(fā)明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽Ⅰ或與SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有至少70％同一性且具有催化氨基酸消旋功能的多肽Ⅱ在酶法催化氨基酸異構(gòu)體消旋中的應(yīng)用。

本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。同時(shí)，在C末端或者N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。故SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加幾個(gè)氨基酸且具有催化氨基酸消旋功能的多肽也屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。

另外，在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽Ⅰ的基礎(chǔ)上的活性片段、或其活性衍生物、類似物也屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。所述“活性片段”、“活性衍生物”和“活性類似物”是指基本上保持與SEQ ID NO.1所示多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。

作為優(yōu)選，所述氨基酸異構(gòu)體為L(zhǎng)-亮氨酸、D-亮氨酸、L-甲硫氨酸或D-甲硫氨酸。研究表明，相較于其他氨基酸，TkAAR對(duì)Leu、Met的消旋酶活力更高。