[發明專利]自動標定聚合酶鏈式反應熒光信號的方法

有效

• 申請號: 202010097836.3
• 申請日: 2020-02-17
• 公開（公告）號: CN111269971B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 袁旭軍;薛曉輝;王振煜;郭彩虹;崔桐;張大偉
• 申請（專利權）人: 上海科源電子科技有限公司;上海理工大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;G01N21/64;G01N21/27
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 徐穎

本發明涉及一種自動標定聚合酶鏈式反應熒光信號的方法，通過兩組(或多組)發射光強和熒光值確定初始發射光強值。再使用初始發射光強對第1孔進行連續掃描15次，15次掃描測試得到的熒光值均在所需區間范圍內，此單孔光強標定完畢，記錄數據；然后執行下一孔的標定，直到所有孔都標定完，第2～n孔的標定均用所得初始發射光強開始執行進行標定。可以將人從繁雜的手工勞動中解放出來去從事更具創新性的工作，同時，自動標定結果無主觀因素干擾，結果一致性優于手動標定。為儀器的生產提供了大大的便利。

技術領域

本發明涉及一種標定技術，特別涉及一種自動標定聚合酶鏈式反應熒光信號的方法。

背景技術

PCR(Polymerase?Chain?Reaction，聚合酶鏈式反應)是一種用于放大擴增特定的DNA(或RNA)片段的分子生物學技術。PCR基因擴增儀是利用PCR(Polymerase?chainreaction，聚合酶鏈反應)技術對特定DNA擴增的一種儀器設備，是分子生物學研究極其重要的工具，主要應用于病原體檢測、藥物療效考核、腫瘤基因檢測、基因表達研究、轉基因研究、單核苷酸多態性(SNP)及突變分析等細分研究方向，在食品檢測、臨床檢驗、疾病控制、檢驗檢疫、科研實驗室、食品安全、化妝品檢測、環境衛生等生命科學領域有著廣泛的應用。

在PCR反應中，無論是定性還是定量分析，分析的都是PCR的終產物。若想分析未經PCR放大的起始模板量，則需借助RT-qPCR技術。RT-qPCR技術即是在PCR的反應過程中加入熒光探針。一種熒光探針的5’端標記有報告基團R可發出熒光信號，3’端標記有熒光淬滅基團Q可吸收熒光信號。當探針完整時，報告基團發出的熒光信號被淬滅基團吸收，從而不被檢測出來。當PCR擴增至探針所在位置時，TaqDNA聚合酶具有的核酸外切酶活性會將探針5’端的報告基團切斷，使其遠離探針本身，這時產生的熒光信號就不能被淬滅基團吸收，而被儀器檢測出來。每擴增一條DNA鏈就會有一個熒光分子產生，通過熒光信號的積累量實時監測整個PCR反應中每一個循環擴增產物量的變化，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。

近幾年國內PCR熒光檢測儀的研發和生產大量涌現，但是與進口儀器相比，國內儀器普遍存在一致性差、生產效率低、成本高等問題。主要是因為國內生產的PCR儀出廠之前需要進行熒光信號標定，而標定方法主要是：設使用光強為Iek(k＝1,2,3……n)的激發光源照射同一管熒光試劑，接收到的熒光強度為Idk(k＝1,2,3……n)。標定前，Iek設置為相同的數值，由于儀器每個孔之間存在細微差異，導致每個孔的熒光結果Idk不一致，并不是全部分布在目標區間內，如圖1所示。標定過程即是調整每個孔的Iek使其Idk能夠分布在目標區間范圍內，如圖2所示。

目前的標定方法是，熒光試劑放在第1孔，首先根據經驗值設置孔1的發射光強，查看接收熒光結果與目標區間的差距后手動調節孔1發射光強，直至孔1熒光結果連續15次均穩定在目標區間內，保存15次穩定的熒光結果；之后，手動將熒光試劑移至下一孔，并將上一孔確定的發射光強值作為待標定孔的初始給定值，重復上一步驟……直至n個孔全部標定完畢。

手動標定不但工作效率低、工作內容枯燥，而且最終的標定結果也不能保持很好的一致性。設計實現自動標定方法，可以將人從繁雜的手工勞動中解放出來去從事更具創新性的工作，同時，自動標定結果無主觀因素干擾，結果一致性優于手動標定。

發明內容

本發明是針對PCR基因擴增儀中標定方法效率低的問題，提出了一種自動標定聚合酶鏈式反應熒光信號，可以將人從繁雜的手工勞動中解放出來去從事更具創新性的工作，提高儀器的生產效率。同時，自動標定結果無主觀因素干擾，結果一致性優于手動標定。

本發明的技術方案為：一種自動標定聚合酶鏈式反應熒光信號的方法，具體包括如下步驟：