[發明專利]一種新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測技術

在審

• 申請號: 202010096344.2
• 申請日: 2020-02-12
• 公開（公告）號: CN111286558A
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 孫兆增;富玉;高俊海;周慧
• 申請（專利權）人: 譜尼測試集團北京檢驗認證科學研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測技術，其特征在于，步驟如下：

1)樣品制備及RNA提取

a.在生物安全柜內，取0.5mL溶液A，將咽拭子浸泡到溶液A中充分攪拌，并將棉拭子中的液體在管壁擠干凈，蓋上管蓋，充分混勻，室溫放置5min；

b.在上述溶液中加入100μL的溶液B，充分混勻，室溫放置3min；

c.12000rpm 4℃離心10min，取上清液；

d.將上清液加入1/2體積的溶液C，室溫靜置2min，并轉移到核酸分離管；

e.12000rpm 4℃離心30s；

f.將離心管中的液體倒掉后，在核酸分離管中加入洗液D 500μL，8000rpm 4℃離心1min；

g.重復步驟f；

h.倒掉離心管中的液體，12000rpm 4℃離心2min，將核酸分離管甩干；

i.將核酸分離管放到新的離心管，加入20-50μL的洗脫液E，靜置2min，12000rpm離心1min；

2)反應體系配置和PCR擴增

j.取熒光定量反應液F、溶液G或內標溶液12μL，加入8μL RNA或陽性模板，直接進行熒光定量PCR反應；反應條件如下：第一步，1次，42℃持續10min；第二步，1次，95℃持續10s；第三步，40個循環，95℃持續5s，然后60℃持續34s；

3)質量控制

空白對照和陰性對照無擴增曲線或Ct＞40；陽性對照在相應的檢測通道有S型擴增曲線；內標溶液在相應的檢測通道有S型擴增曲線；

4)結果分析與判定

在檢測有效的情況下，利用熒光定量反應液F、溶液G進行擴增的結果，CT值同時小于或等于37，判斷為新冠狀病毒核酸檢測陽性；CT值同時大于或等于40，判斷為新冠狀病毒核酸檢測陰性；37＜CT值＜40，需要重復試驗，如果CT值＜40，判斷為陽性，CT值≥40，判為陰性。

2.根據權利要求1所述的一種新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測技術，其特征在于，溶液A為Trizol試劑，溶液B為三氯甲烷，溶液C為乙醇，洗液D為75％乙醇溶液，洗脫液E為TE，熒光定量反應液F為RNA反轉錄酶、DNA聚合酶、dNTP、引物、引物探針的混合溶液，溶液G為DEPC處理水；其中，引物和對應引物探針分為X和Z兩種，引物X上游5`-gaccccaaaatcagcgaaat-3`、下游5`-tctggttactgccagttgaatctg-3`和探針5`-FAM-accccgcattacgtttggtggacc-TAMRA-3`，引物Z上游5`-ttacaaacattggccgcaaa-3`、下游5`-gcgcgacattccgaagaa-3`和探針5`-FAM-acaatttgcccccagcgcttcag-TAMRA-3`。