[發明專利](R,S)-2,4-滴丙酸降解菌株及特異性降解其(S)-型異構體的雙加氧酶基因

有效

• 申請號: 202010095006.7
• 申請日: 2020-02-17
• 公開（公告）號: CN111321092B
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發明（設計）人: 蔣建東;張龍;陳凱;胡順利
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/53;C12N9/02;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/82;A01H5/00;A62D3/02;A62D101/04;A62D101/22;A62D101/28;C12R1/01;C12R1/19
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

本發明公開了(R,S)?2,4?滴丙酸降解菌株及特異性降解其(S)?型異構體的雙加氧酶基因。一株(R,S)?DCPP降解菌株Sphingopyxis sp.DBS4，菌種保藏號為CCTCC M 20191082。特異性降解(S)?DCPP的雙加氧酶基因，核苷酸序列為SEQ ID NO.1。利用該基因構建的工程菌株能高效表達特異性降解(S)?DCPP的雙加氧酶，同時對苯氧羧酸類除草劑2,4?D和(S)?MCPP均有明顯的降解效果。生產的酶制劑可用于(S)?DCPP，2,4?D及(S)?MCPP等苯氧羧酸類除草劑殘留的去除，也可用于手性苯氧羧酸類除草劑旋光異構體手性拆分。

技術領域

本發明屬于應用環境污染修復以及手性農藥的酶學拆分領域，涉及(R,S)-2,4-滴丙酸降解菌株及特異性降解其(S)-型異構體的雙加氧酶基因。

背景技術

我國目前正在使用的農藥中具有手性結構的農藥(手性農藥)約占40％。與此同時，隨著農藥品種的不斷發展，農藥類手性化合物的數量顯著增加。除草劑的使用量雖已居各大農用化合物之首，但相對于殺蟲劑等其他手性農藥，對除草劑手性(手性除草劑)問題的研究卻相對較少。手性除草劑的使用雖然提高了農業的生產效率，但同時帶來嚴重的環境問題。研究表明，具有手性結構的除草劑在藥效、環境安全性等方面存在不可忽視的對映異構體差異。雖然手性化合物的對映異構體具有相同的理化性質，但其異構體間卻可能具有不同的生物活性和生態毒理；而生物體對化合物的吸收、生物轉化和新陳代謝等也可能存在立體選擇性。手性化合物的不徹底認識已給人類帶來了慘痛的教訓(如沙利度胺)。由于大多數手性除草劑至今仍是以外消旋體(具有旋光性的手性分子與其對映體的等摩爾混合物)形式生產和施用，不可避免地導致手性除草劑的不同異構體同時進入到生物體、土壤和水體等環境體系中。

苯氧羧酸類除草劑是α-C結構帶有取代基的羧酸類化合物，由于其成本低、速度快等優勢被大規模生產和使用，是目前世界使用量第二的選擇性除草劑，更是位居闊葉類雜草除草劑使用量榜首。2,4-滴丙酸(DCPP)是全世界廣泛使用的典型苯氧羧酸類手性除草劑之一。DCPP的除草活性和生長激素藥效幾乎全部集中于R-型異構體[(R)-DCPP]，S-型異構體[(S)-DCPP]不具有除草活性且具有輕微地抗生長素活性。DCPP屬于苗后除草劑，主要通過抑制乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的合成，致使脂肪酸的合成停止，細胞的生長、分裂不能正常進行，從而抑制雜草生長。DCPP具有潛在的致癌和致突變性，其揮發性弱，可溶性大，且難以生物降解和直接光解，環境殘留率較高。DCPP經施用后，只有少部分能被植物體吸收，其他大部分都會直接或間接進入到周邊土壤中，由于其水溶性較大，易從土壤中隨雨水或灌溉水進入水體環境。因此，對水生環境危害極大。許多國家都在地表水和地下水中檢出DCPP含量超過規定的最大殘留量。目前，雖然已經有商品化的(R)-DCPP出售，但出于成本的考慮，DCPP仍主要以外消旋體(R,S)-DCPP的形式施用。此外，DCPP的結構是不穩定的，在一定條件下它的對映體之間會發生相互轉化。在單一活性對映體單體施用之后，還沒完全發揮藥效之前，可能已經外消旋化了。與此同時，(S)-型異構體雖然沒有除草活性，但其對非靶標生物可能有更大的毒性。因此，DCPP的殘留已經成為生態環境保護急需解決的問題。微生物修復除草劑污染的方法是一種簡單、高效、廉價和無二次污染的方法，比化學方法、物理方法修復農藥污染具有更多優勢。微生物修復除草劑殘留污染的本質是微生物產生的酶對除草劑的降解作用，從微生物中提取的降解酶系來消除除草劑殘留在國外已有成功的先例，降解酶的來源可以通過從降解菌中提取，也可以采用基因工程手段構建高效表達菌株來獲得。手性除草劑DCPP降解酶基因的獲得在苯氧羧酸類除草劑污染的修復領域，甚至是DCPP不同手性異構體的拆分方面都有巨大的應用潛力。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供能同時降解手性除草劑(R,S)-DCPP兩種異構體的降解菌株。

本發明的另一目的是提供從該降解菌株中克隆到的特異性降解(S)-DCPP的雙加氧酶基因。

本發明的又一目的是提供該菌株、基因或基因編碼蛋白的應用。