[發(fā)明專利]過表達(dá)hACE2基因的NK細(xì)胞制劑的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010094664.4
• 申請(qǐng)日: 2020-02-16
• 公開（公告）號(hào): CN111206050A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王清路;許曉松;付娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王清路;許曉松
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/57;C12N5/10
• 代理公司: 淄博啟智達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 37280
• 代理人: 任永哲

1.一種過表達(dá)hACE2基因的NK細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)NK細(xì)胞分離與激活

NK細(xì)胞分離，培養(yǎng)，激活，繁殖，收集；

(2)構(gòu)建hACE2過表達(dá)載體

①引物設(shè)計(jì)和合成：根據(jù)hACE2 mRNA序列設(shè)計(jì)引物；

②總RNA的提取：收集A549細(xì)胞，提取總RNA；

③采用RT-PCR擴(kuò)增hACE2基因；

④將hACE2基因與pEGFP-N1質(zhì)粒片段連接得到hACE2過表達(dá)載體pEGFP-N1-hACE2；

(3)電轉(zhuǎn)將hACE2過表達(dá)載體轉(zhuǎn)進(jìn)NK細(xì)胞

NK細(xì)胞中加入電轉(zhuǎn)液和hACE2過表達(dá)載體進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)結(jié)束后，繼續(xù)培養(yǎng)，收集細(xì)胞；

(4)采用帶有hACE2抗體的磁珠篩選表達(dá)hACE2的細(xì)胞

電轉(zhuǎn)結(jié)束后收集的細(xì)胞采用帶有hACE2抗體的磁珠篩選進(jìn)行分離，分離所得hACE2陽性NK細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，即得過表達(dá)hACE2基因的NK細(xì)胞制劑。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過表達(dá)hACE2基因的NK細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的引物如下：

ACE2F：5’-catgaagcctatgtcaagctcttcctggctcc-3’

ACE2R：5’-catggaattcctaaaaggaggtctgaacatc-3’。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過表達(dá)hACE2基因的NK細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的電轉(zhuǎn)液組成如下，以體積百分比計(jì)：

無鈣鎂PBS 90％

無血清培養(yǎng)基RPMI 1640 10％；

以無鈣鎂PBS和無血清培養(yǎng)基RPMI 1640的總體積為100％計(jì)，EDTA加入量為30g/L，蔗糖加入量為200mmol/L。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過表達(dá)hACE2基因的NK細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的電轉(zhuǎn)液的制備方法是將無鈣鎂PBS與無血清培養(yǎng)基RPMI 1640混合，然后加入EDTA和蔗糖，溶解后再過濾除菌，即得。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過表達(dá)hACE2基因的NK細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)間為48-72h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過表達(dá)hACE2基因的NK細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述的電轉(zhuǎn)結(jié)束后收集的細(xì)胞采用帶有hACE2抗體的磁珠篩選進(jìn)行分離是電轉(zhuǎn)結(jié)束后收集的細(xì)胞用PBS清洗兩次，帶有hACE2抗體的磁珠結(jié)合表達(dá)hACE2的NK細(xì)胞，分離得到hACE2陽性NK細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的過表達(dá)hACE2基因的NK細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述的電轉(zhuǎn)結(jié)束后收集的細(xì)胞采用帶有hACE2抗體的磁珠篩選進(jìn)行分離是收集含有不超過6×10⁶個(gè)細(xì)胞的200μl懸液，按1∶20體積比加入兔抗人hACE2抗體，4℃冰箱孵育1h；之后按照20μl小鼠抗兔IgG1磁珠對(duì)應(yīng)80μl細(xì)胞懸液比例，4℃冰箱孵育15min，PBS緩沖液清洗2次后制備1ml細(xì)胞懸液備用；將PBS緩沖液濕潤后的MS分選柱子放入分選器中，加入制備好的細(xì)胞懸液，hACE2陽性的NK細(xì)胞會(huì)通過物理磁場力吸附在分選柱子中，hACE2陰性NK細(xì)胞會(huì)直接流出分選柱子。