[發明專利]一種先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的檢測方法在審
| 申請號： | 202010094368.4 | 申請日： | 2020-02-15 |
| 公開（公告）號： | CN111321207A | 公開（公告）日： | 2020-06-23 |
| 發明（設計）人： | 竺曉凡;常麗賢;袁衛平;鄒堯;劉曉明;阮敏;初雅靜 | 申請（專利權）人： | 中國醫學科學院血液病醫院（中國醫學科學院血液學研究所） |
| 主分類號： | C12Q1/6869 | 分類號： | C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 天津市尚儀知識產權代理事務所(普通合伙) 12217 | 代理人： | 王山 |
| 地址： | 300041 *** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 先天性 骨髓 衰竭 性疾病 基因 檢測 方法 | ||
1.一種先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：
a. 利用二代測序對樣本進行檢測；
b. 將測序結果分為基因型明確和基因型不明確；
c. 對基因型不明確的樣本進行RT-PCR、單細胞單點突變驗證和微量蛋白檢測，明確基因分型。
2.根據權利要求1所述的一種先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的檢測方法，其特征在于：步驟c中，同時設定正常對照組和基因型明確對照組。
3.根據權利要求1所述的一種先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的檢測方法，其特征在于：步驟c中，單細胞DNA擴增及Sanger測序方法如下：
a.利用熒光激活細胞分選術將外周血淋巴細胞分到96孔板中；
b.利用單細胞DNA擴增試劑盒對細胞進行DNA擴增；
c.用已知突變位點引物進行擴增后，利用Sanger測序技術進行突變位點分析。
4.根據權利要求1所述的一種先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的檢測方法，其特征在于：步驟c中，毛細胞免疫電泳進行微量蛋白檢測方法如下：
a.在6孔板的每個孔中分別培養外周血淋巴細胞，分為2組，每組3個孔，一組加入絲裂霉素C，另一組不加絲裂霉素C，培養18小時；
b.所有細胞加入細胞裂解液，加入裂解液后在冰上裂解30min；
c.以上蛋白裂解液與加入等電點標準條帶1的預混G2按3:1比例混勻，實驗中主要的一抗為1:50的濃度；
d.然后加入抗人IgG-HRP 二抗，利用抗體稀釋buffer將二抗稀釋為1:100的濃度, 然后與 luminol/peroxide 按1:1比例混合；
e.在加入二抗和luminol/peroxide后，將每個樣品加入到NanoPro 1000儀器上，根據制造商的說明書進行操作；
f.利用compass軟件2.5.11識別和量化化學發光峰，并可視化地優化跟蹤。
5.根據權利要求4所述的一種先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的檢測方法，其特征在于：步驟a中，至少培養2000個外周血淋巴細胞。
6.根據權利要求4所述的一種先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的檢測方法，其特征在于：步驟b中，細胞裂解液的成分為Bicine/CHAPS 裂解液 二甲基亞砜抑制劑混合物和水溶性抑制劑混合物。
7.根據權利要求4所述的一種先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的檢測方法，其特征在于：步驟c中，一抗包括兔抗-FANCD, 兔抗-FANCD1, 兔抗-FANCM和兔抗-GAPDH，GAPDH作為內參。
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