[發(fā)明專利]一種特異性識別β-乳球蛋白的核酸適配體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010094212.6
• 申請日: 2020-02-15
• 公開（公告）號: CN111172166B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 段諾;齊碩;吳世嘉;王周平
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/68
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務(wù)所(普通合伙) 32228
• 代理人: 聶啟新

本發(fā)明屬于生物和醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種特異性識別β?乳球蛋白的核酸適配體及其應(yīng)用。所述核酸適配體的序列為SEQ ID NO.1所示的序列；或與SEQ ID NO.1所示的序列具有60％以上同源性并且能夠特異性識別β?乳球蛋白的序列；或由SEQ ID NO.1所示的序列衍生的能夠特異性識別β?乳球蛋白的序列。該核酸適配體能特異性結(jié)合牛乳及乳制品中過敏原β?乳球蛋白，為過敏原β?乳球蛋白的高靈敏度、低成本檢測提供一種新的工具。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物和醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種特異性識別β-乳球蛋白的核酸適配體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

食物過敏是部分人群對某些食物產(chǎn)生的不良反應(yīng)(包括IgE介導(dǎo)和非IgE介導(dǎo)的兩大類免疫反應(yīng))。食物過敏反應(yīng)不僅會嚴重影響患者的生活質(zhì)量，還能引起患者營養(yǎng)不良而出現(xiàn)健康性問題，如哮喘、胃腸道和皮膚炎癥等，嚴重者會引起過敏性休克危及生命。

牛乳及乳制品因含有人體必需的氨基酸、豐富的礦物質(zhì)，逐漸成為人類健康飲食的重要組成部分。但同時作為世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)劃定的八大類易過敏食物之一，因牛乳及乳制品中含有多種致敏蛋白(αs1-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白等)嚴重影響著的部分人群的身體健康。流行病學(xué)調(diào)查顯示，高達8％的嬰幼兒和1％-2％的成人對牛乳過敏，近年來由于生活方式的改變、微生物的暴露、飲食習(xí)慣的改變等多種因素，嬰幼兒的腸道免疫功能越來越低，嬰幼兒牛乳過敏發(fā)生率正呈逐年上升的趨勢。

β-乳球蛋白約占牛乳蛋白含量的10％，約占乳清蛋白總量的50％，人乳中不含有β-乳球蛋白，且IgE介導(dǎo)的牛乳過敏病人中，約82％的患者對β-乳球蛋白過敏，因此β-乳球蛋白被認為是牛乳中主要的過敏原成分。對牛乳及乳制品中過敏原β-乳球蛋白的高靈敏度檢測，為易過敏群體提供必要的飲食指導(dǎo)具有重要的意義。

目前食物中牛乳過敏原分析檢測常用的方法：(1)基于色譜分析的高效液相色譜方法(HPLC)，但是儀器費用昂貴，使用場景局限性大，成本較高；(2)基于識別特征基因的熒光定PCR(qPCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)，然而卻存在特異性差、操作復(fù)雜的問題；(3)基于抗體特異性識別的酶聯(lián)免疫方法(ELISA)，然而抗體屬于蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性差，靈敏度低，很難以較低的成本高靈敏度分析食物中過敏原。

核酸適配體(aptamer)是通過指數(shù)富集配體進化技術(shù)(SELEX)從人工合成的隨機核苷酸文庫中篩選獲得能特異性結(jié)合靶物質(zhì)的單鏈寡核苷酸，作為一種新型的“抗體”，適配體可形成特定的三維構(gòu)象(發(fā)卡、假結(jié)、凸環(huán)和G-四聯(lián)體等)，通過空間結(jié)構(gòu)的匹配、氫鍵、范德華力和靜電相互作用等分子間相互作用力與靶物質(zhì)進行高親和性結(jié)合。與抗體相比具有很多優(yōu)勢：(1)人工合成，不依賴動物體內(nèi)免疫，批次之間的差異??；(2)穩(wěn)定性好，可長期保存，耐熱性強；(3)親和力高，特異性強，適配體Kd可低至納摩爾級別，能很好的區(qū)分結(jié)構(gòu)類似物；(4)易于修飾，適配體兩端標記化學(xué)基團(如FAM、ROX、FITC和生物素等)不影響其親和性，并可拓展其適用范圍，被廣泛應(yīng)用于基于適配體識別的檢測技術(shù)中。

Mohammed Zourob等的英文文獻中提供了一條結(jié)合β-乳球蛋白的核酸適配體，并利用其構(gòu)建了電化學(xué)的檢測方案。所述文獻利用靶標固定的方法，將β-乳球蛋白固定在瓊脂糖微球上篩選富集了β-乳球蛋白的核酸適配體。檢測部分將核酸適配體吸附在氧化石墨烯上，當存在β-乳球蛋白時，因核酸適配體與其特異性結(jié)合而使得從氧化石墨烯上脫落引起電化學(xué)信號的變化。該方案的缺點是：適配體Kd值較大且并未研究適配體的特異性，因此實際樣品檢測中干擾因素過多，檢出限較高，另外適配體與β-乳球蛋白的結(jié)合機理不清楚。

發(fā)明內(nèi)容