[發明專利]提高基因檢測靈敏度和速度的方法

在審

• 申請號: 202010093742.9
• 申請日: 2020-02-14
• 公開（公告）號: CN112795629A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 李治國
• 申請（專利權）人: 李治國
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京化育知識產權代理有限公司 11833
• 代理人: 尹均利

本發明涉及提高核酸檢測靈敏度和速度的方法，在利用無外切活性的聚合酶進行核酸合成時，增加外圍或者內部結構中引物的數量，無論是針對DNA還是RNA的檢測，都可以顯著提高基因檢測的靈敏度和速度的速度。使用該技術，可以進一步發揮核酸檢測的優勢，在各種應用場景中，都意義重大。

[技術領域]

本發明涉及分子生物學領域，更具體地，涉及基因檢測的方法。

[背景技術]

多聚集鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)技術發明至今已近20年了，在這期間技術得到了不斷的發展，近年來出現的實時熒光定量PCR(real-time quantitativePCR)技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優點成為了分子生物學研究中的重要工具。

上世紀9O年代以來，出現了幾種新的核酸擴增方法：核酸等溫擴增法(nucleicacid sequence—basedamplification，NAS-BA)、自序列復制法(self—SUS—rainedsequence replication，3SR)和鏈置換擴增法(strand displacement amplification，SDA)等。Noto—mi等]于2000年開發了一種新穎的恒溫核酸擴增方法，即環介導等溫擴增法(1oop—mediated isothermalamplification。LAMP)，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件(60-65℃左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應，不需要模板的熱變性、長時間溫度循環、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。LAMP是一種嶄新的DNA擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點，具有替代PCR方法的可能性。

無論是PCR檢測系統，還是恒溫擴增系統，雖然已經是最為靈敏的檢測手段了，但是在實際工作中，仍然會碰到靈敏度不夠的情況。另外，檢測的速度也是大家

[發明內容]

在不具有外切活性的DNA聚合酶進行的核酸擴增反應中，如果在引物的外圍或者結構的內部增加引物的數量，因為聚合酶不具有外切活性，每一次擴增的產物都會被保留下來，聚合的過程就是鏈置換的過程。后面的引物會把前面引物合成的新鏈剔出雙鏈，形成裸漏的單鏈，會更容易結合新的引物，繼續基因擴增。另外，因為引物位置不同，相互之間不影響和匹配區域的結合，會顯著增加退火形成雙鏈的機會。因此，核酸擴增的產物將會大大的增加，最終核酸合成的速度和靈敏度將會得到極大的提高。

LAMP方法是依靠具有鏈置換功能的聚合酶Bst大片段參與的環介導的基因合成，只需要一個反應溫度，利用引物之間形成的發卡結構進行連續擴增。利用本發明，在引物的外圍和環結構的內部增加引物的數量，可以將LAMP方法合成核酸的速度變的更快。通過實驗對比，在增加引物的情況下，核酸合成的速度和靈敏度都得到了顯著的提高。

另外，本發明同樣適用于反轉錄定量PCR的反轉錄過程。在PCR引物的外圍增加引物，同時選擇無Rnase H活性的逆轉錄酶，或者使用帶有逆轉錄功能的鏈置換聚合酶，可以在逆轉錄的過程中對模板進行倍增，提高后續PCR檢測的靈敏度和速度。

附圖說明

圖1為本發明的第一實驗效果圖；

圖2為本發明的第二實驗效果圖；

圖3為本發明的第三實驗效果圖；

圖4為本發明的第四實驗效果圖；

圖5為本發明的第五實驗效果圖；

圖6為本發明的第六實驗效果圖；

圖7為本發明的第七實驗效果圖。

[具體實施方式一]

以下通過以下實施例來闡述本發明所述提高核酸合成的靈敏度和速度的方法。

材料與方法