[發(fā)明專利]用于同時(shí)檢測(cè)三種微孢子蟲(chóng)的引物組及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010093114.0
• 申請(qǐng)日: 2020-02-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111269997B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜宏波;寧梓健;包杰;陳啟軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6893
• 分類號(hào): C12Q1/6893;C12N15/11
• 代理公司: 北京華清迪源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11577
• 代理人: 杜立軍

本發(fā)明公開(kāi)了用于同時(shí)檢測(cè)三種微孢子蟲(chóng)的引物組及其應(yīng)用，所述引物組包括用于檢測(cè)肝腸胞蟲(chóng)的第一特異性引物對(duì)，用于檢測(cè)鹵蟲(chóng)腸孢子蟲(chóng)的第二特異性引物對(duì)以及用于檢測(cè)河蟹微孢子蟲(chóng)的第三特異性引物對(duì)；其中，所述第一特異性引物對(duì)是針對(duì)蝦肝腸胞蟲(chóng)ptp2基因，所述第二特異性引物對(duì)是針對(duì)鹵蟲(chóng)腸孢子蟲(chóng)STPK基因，所述第三引物對(duì)是針對(duì)河蟹微孢子蟲(chóng)swp7基因。本發(fā)明通過(guò)多重PCR反應(yīng)可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)蝦蟹中蝦肝腸胞蟲(chóng)、鹵蟲(chóng)腸孢子蟲(chóng)和河蟹微孢子蟲(chóng)的感染情況，敏感性和特異性較好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)微孢子蟲(chóng)的引物組及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

蝦肝腸胞蟲(chóng)(Enterocytozoon?hepatopenaei，EHP)可感染多種經(jīng)濟(jì)蝦類，感染后會(huì)造成對(duì)蝦大小不齊，生長(zhǎng)減慢或停止，嚴(yán)重降低養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)價(jià)值。鹵蟲(chóng)腸孢子蟲(chóng)(Enterocytospora?Artemiae)發(fā)現(xiàn)于水產(chǎn)上常用餌料-鹵蟲(chóng)中，會(huì)感染經(jīng)濟(jì)蝦類中華小長(zhǎng)臂蝦，感染了鹵蟲(chóng)腸孢子蟲(chóng)的中華小長(zhǎng)臂蝦會(huì)出現(xiàn)肌肉白濁、肝胰腺糜爛的現(xiàn)象。河蟹微孢子蟲(chóng)(Hepatospora?eriocheir)是一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的孢子蟲(chóng)，主要寄生于河蟹的肝胰腺，嚴(yán)重威脅河蟹的健康養(yǎng)殖。上述三種微孢子蟲(chóng)給甲殼動(dòng)物的養(yǎng)殖造成了很大影響。

目前，鑒于蝦蟹類微孢子蟲(chóng)感染的復(fù)雜性，越來(lái)越多病害的發(fā)生不止一種微孢子蟲(chóng)的感染，同時(shí)通過(guò)臨床診斷難以區(qū)別。目前常規(guī)的檢測(cè)方法是形態(tài)學(xué)檢測(cè)，而微孢子蟲(chóng)個(gè)體微小，不易于觀察，靈敏性和特異性均較低，容易造成誤檢。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明提供用于同時(shí)檢測(cè)三種微孢子蟲(chóng)的引物組及其應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)的微孢子蟲(chóng)過(guò)程復(fù)雜，靈敏度、特異性低的問(wèn)題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

用于同時(shí)檢測(cè)三種微孢子蟲(chóng)的引物組，所述引物組包括用于檢測(cè)肝腸胞蟲(chóng)的第一特異性引物對(duì)，用于檢測(cè)鹵蟲(chóng)腸孢子蟲(chóng)的第二特異性引物對(duì)以及用于檢測(cè)河蟹微孢子蟲(chóng)的第三特異性引物對(duì)；其中，所述第一特異性引物對(duì)是針對(duì)核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的蝦肝腸胞蟲(chóng)ptp2基因，所述第二特異性引物對(duì)是針對(duì)核苷酸序列如SEQ?ID?NO.8所示的鹵蟲(chóng)腸孢子蟲(chóng)STPK基因，所述第三特異性引物對(duì)是針對(duì)核苷酸序列如SEQ?ID?NO.9所示的河蟹微孢子蟲(chóng)swp7基因。

優(yōu)選地，所述第一特異性引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?IDNO.2所示；

所述第二特異性引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示；

所述第三特異性引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6所示。

本發(fā)明的用于同時(shí)檢測(cè)三種微孢子蟲(chóng)的引物組，在制備下述a)或b)中的應(yīng)用；

a)PCR擴(kuò)增蝦肝腸胞蟲(chóng)ptp2基因、鹵蟲(chóng)腸孢子蟲(chóng)STPK基因和河蟹微孢子蟲(chóng)swp7基因片段的試劑或試劑盒；

b)檢測(cè)蝦肝腸胞蟲(chóng)ptp2基因、鹵蟲(chóng)腸孢子蟲(chóng)STPK基因和河蟹微孢子蟲(chóng)swp7基因型的試劑或試劑盒。

優(yōu)選地，上述引物組，在PCR擴(kuò)增蝦肝腸胞蟲(chóng)ptp2基因、鹵蟲(chóng)腸孢子蟲(chóng)STPK基因和河蟹微孢子蟲(chóng)swp7基因片段，或檢測(cè)蝦肝腸胞蟲(chóng)ptp2基因、鹵蟲(chóng)腸孢子蟲(chóng)STPK基因和河蟹微孢子蟲(chóng)swp7基因型中的應(yīng)用；

所述應(yīng)用中，利用所述第一特異性引物對(duì)、第二特異性引物對(duì)、第三特異性引物對(duì)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，分別得到第一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、第二PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及第三PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

將所述第一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、第二PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、第三PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和蝦肝腸胞蟲(chóng)ptp2基因、鹵蟲(chóng)腸孢子蟲(chóng)STPK基因和河蟹微孢子蟲(chóng)swp7基因片段標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行電泳，若所述第一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為880bp，判斷所述待測(cè)樣品中含蝦肝腸胞蟲(chóng)；