[發明專利]基于間充質干細胞/內皮祖細胞作為種子細胞構建的基質依賴型組織工程骨及其制備方法

在審

• 申請號: 202010091980.6
• 申請日: 2020-02-14
• 公開（公告）號: CN111282020A
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 董世武;董睿;羅飛;鐘華
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫大學
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/56;A61L27/36;C12N5/071;C12N5/0775
• 代理公司: 重慶信航知識產權代理有限公司 50218
• 代理人: 孫章虎

本發明公開了基于間充質干細胞/內皮祖細胞作為種子細胞構建的基質依賴型組織工程骨的制備方法，將間充質干細胞和內皮祖細胞按1:1比例，種植于多孔骨支架材料上構建組織工程復合體，再在體外加入成骨誘導培養液繼續培養13～15天，在?70～80℃冷凍48～72小時，凍干24小時～30小時，冷凍保存1～3個月，獲得基質依賴型組織工程骨。體外研究結果顯示，用本發明方法構建的基于間充質干細胞/內皮祖細胞作為種子細胞的基質依賴型組織工程骨，體外能夠顯著促進內皮祖細胞遷移、劃痕修復和管腔形成，以及促進間充質干細胞的成骨分化；體內實驗顯示其能夠顯著促進新骨形成，成功修復骨缺損。

技術領域

本發明屬于組織工程技術領域，涉及基于間充質干細胞/內皮祖細胞作為種子細胞構建的基質依賴型組織工程骨及其制備方法。

背景技術

創傷、腫瘤和感染等導致的大段骨缺損救治一直是臨床治療的難點之一。自體骨移植目前仍然是臨床上骨移植的“金標準”，但存在取骨量少、取骨區創傷等限制。組織工程骨(tissue engineering bone，TEB)是近年來研究的熱點，并取得了良好的臨床效果，但也存在活細胞依賴、自體細胞依賴和儲運條件苛刻等問題。

為了解決上述問題，我們前期建立了含有臍帶間充質干細胞分泌的多種蛋白的骨基質材料及制備方法(專利ZL 2013 1 0449152.5)，并在此基礎上，提出了“基質依賴型組織工程骨(Extracellular matrix-based tissue engineering bone，ECM-TEB)”的構建概念和體系。即通過去除種子細胞活性、保留細胞分泌的多種細胞因子等活性蛋白的方式構建獲得ECM-TEB。該技術方式雖然除去細胞活性，但細胞以自分泌方式層層包裹于支架材料上的細胞因子和基質蛋白仍然被保留，體內移植后在酶的作用下包裹于基質中的細胞因子緩慢釋放于損傷處并參與骨重建，因此去細胞活性的ECM-TEB所加載和釋放的生物活性蛋白均滿足生理環境的需求。其基本構建策略如下：將間充質干細胞(mesenchymal stemcells，MSC)與骨支架材料復合，共培養14天，將細胞-支架復合物在-80℃冷凍48小時，凍干24小時，冷凍保存3個月以顯著降低免疫原性形成MSC為種子細胞的ECM-TEB。這種策略80％活性蛋白得以保留，有效克服了個體化組織工程骨所需時間長、耗費大，且受患者自體干細胞狀態的影響，制備簡單易行、效果顯著、方便推廣，為組織工程的研究提供了新的思路。

骨重建的動態平衡靠骨組織內各類細胞的相互協作來實現，故在ECM-TEB構建中若能建立不同類型的細胞進行共培養，將更加真實的模擬體內成骨的微環境。以MSC作為單一種子細胞所構建的MSC ECM-TEB，在修復較小尺寸骨缺損時展現出良好的應用前景，但修復較大骨缺損時，因缺乏完善的脈管系統，常導致缺損部位血管化差，限制了組織工程骨的臨床應用范圍。隨著再生醫學的發展，具有成血管潛能的ECM-TEB對于修復大段骨缺損意義重大。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPC)可分化為血管內皮細胞生成血管，且在特定微環境下可促進MSCs歸巢與成骨，因此，這為本發明在MSC作為成骨分化的種子細胞的同時，引入EPC作為種子細胞，探索該“復合型”種子細胞所構建的MSC/EPC基質依賴型組織工程骨具有極好的臨床意義。

目前，關于內皮祖細胞作為種子細胞之一進行基質依賴型組織工程骨構建，并進行治療骨缺損方面尚未見任何報道。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于針對目前應用大塊組織工程骨修復大段骨缺損時，建立一種新型組織工程骨構建，引入EPC作為種子細胞之一，從而解決僅僅以MSC作為單一種子細胞來源構筑基質依賴型組織工程骨，存在難以更加真實的仿生體內成骨微環境的問題，以及易導致缺損部位血管化差的問題。本發明提供如下技術方案：