[發明專利]一種苦瓜外泌體及其提取方法與應用

有效

• 申請號: 202010090819.7
• 申請日: 2020-02-13
• 公開（公告）號: CN111218419B
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 齊素華;顧兵;蔡恒;黃琳燕;王彥玲
• 申請（專利權）人: 徐州醫科大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;A61K36/42;A61P9/10;A61K131/00
• 代理公司: 徐州千秋知識產權代理事務所(普通合伙) 32556
• 代理人: 周敏

本發明公開了一種苦瓜外泌體及其提取方法與應用，提取步驟如下：取適量新鮮云南山野苦瓜，去籽洗凈并晾干；榨取苦瓜汁，將苦瓜汁連續離心，離心后取上清，棄沉淀；將取得的上清超速離心，棄上清，取沉淀，沉淀懸浮于1?2mL的磷酸緩沖鹽溶液中；將懸浮液用0.22μm的濾膜過濾，濾液再次于超速冷凍離心機中離心，棄上清，取沉淀，沉淀懸浮于1?2mL的磷酸緩沖鹽溶液中。提取的苦瓜外泌體可用于制備治療缺血性腦中風藥物。本發明的提取方法方便有效，提取純度高，提取的苦瓜外泌體具有腦卒中后神經損傷的保護作用。

技術領域

本發明涉及醫藥領域，具體涉及一種苦瓜外泌體及其提取方法與應用。

背景技術

缺血性腦中風具有高發病率、高致殘率、高死亡率的特點。腦中風包括出血性腦中風和缺血性腦中風，其中缺血性腦中風約占87％，缺血性腦中風主要由于大腦血管堵塞造成血流減少，大腦供血不足引起。臨床上治療腦中風的方法是用t-PA溶栓，但是t-PA具有嚴格的治療時間窗為4.5h，超過治療時間窗會引起出血轉換(更嚴重的損傷)，臨床上迫切需要更為安全、有效的治療藥物。

外泌體(Exosomes)是細胞釋放到環境中粒徑大小為30-200nm的細胞外囊泡，呈蝶狀，由特定的蛋白質、脂質和核酸物質組成。其攜帶的多種miRNA能與靶細胞膜表面的特定受體結合，調控多種信號通路，調節多種生理和病理過程。能否從苦瓜中提取外泌體，并用于缺血性腦卒中的治療中，未見報道。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種苦瓜外泌體的提取方法，能夠從植物苦瓜中提取外泌體。

本發明的目的之二是提供上述方法提取的苦瓜外泌體在制備治療缺血性腦中風藥物中的應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：一種苦瓜外泌體的提取方法，包括以下步驟：

(1)取適量新鮮云南山野苦瓜，去籽洗凈并晾干；

(2)晾干后榨取苦瓜汁，將苦瓜汁連續離心，于4℃，1000g，10min；3000g，20min；10000g，40min；離心后取上清，棄沉淀；

(3)將取得的上清超速離心，于超速冷凍離心機中4℃，150000g，離心90min，離心后棄上清，取沉淀，沉淀懸浮于1-2mL的PBS緩沖液中；

(4)將懸浮液用0.22μm的濾膜過濾，濾液再次于超速冷凍離心機中4℃，150000g，離心90min，離心后棄上清，取沉淀，沉淀懸浮于1-2mL的PBS緩沖液中。

本發明還提供上述方法提取的苦瓜外泌體。

利用透射電鏡觀察，苦瓜外泌體是具有清晰膜的茶托樣膜泡結構，粒徑主要集中在120nm左右，免疫印跡檢測存在三種標志蛋白CD54、CD63、TSG101。

本發明還提供上述方法提取的苦瓜外泌體在制備治療腦中風藥物中的應用。

利用大鼠大腦中動脈梗塞MCAO(middle cerebral arteryoc-clusion，MCAO)腦中風模型，驗證苦瓜外泌體的腦保護作用。栓塞缺血2小時，再通血管前30分鐘靜脈注射苦瓜外泌體(800ug/kg)，在復灌24小時進行：TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染色觀察梗死面積，mNSS神經評分，EB染色并EB定量，觀察BBB(血腦屏障)的通透性。

結果發現，苦瓜外泌體能夠減少MCAO大鼠的腦梗死面積，能減輕MCAO大鼠的神經評分，減少EB的滲透、減輕血腦屏障的損傷。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

1.本發明提供的苦瓜外泌體提取方法，方便有效，雜質去除率高，提取純度高。