[發明專利]PTPN22基因拷貝數變異檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010090321.0
• 申請日: 2020-02-13
• 公開（公告）號: CN111206090A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發明（設計）人: 徐瑤;鄭瀟;李家俊;盛杰;郭輝;龍文林;卓情;張同存
• 申請（專利權）人: 武漢科技大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6851
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 謝洋

1.一種PTPN22基因拷貝數變異檢測試劑盒，其特征在于，包括用于檢測PTPN22基因CNV區域的第一探針和第一引物對以及用于檢測內參基因的第二探針和第二引物對；

所述第一探針的序列如SEQ ID NO.1所示，且所述第一探針的5’端結合第一熒光基團，3’端結合第一熒光淬滅基團；

所述第一引物對的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

所述內參基因為AP3B1基因，所述第二探針的序列如SEQ ID NO.4所示，且所述第二探針的5’端結合第二熒光基團、3’端結合第二熒光淬滅基團；

所述第二引物對的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

2.根據權利要求1所述的PTPN22基因拷貝數變異檢測試劑盒，其特征在于，所述第一熒光基團為FAM，第一熒光淬滅基團為MGB。

3.根據權利要求1所述的PTPN22基因拷貝數變異檢測試劑盒，其特征在于，所述第二熒光基團為HEX，第二熒光淬滅基團為TRMRA。

4.根據權利要求1至3任一項所述的PTPN22基因拷貝數變異檢測試劑盒，其特征在于，還包括含DNA聚合酶的預混液。

5.權利要求1至4任一項所述的PTPN22基因拷貝數變異檢測試劑盒在采用ddPCR檢測PTPN22基因拷貝數變異中的應用。

6.一種PTPN22基因拷貝數變異檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

提取模板DNA；

利用權利要求1至4任一項所述的PTPN22基因拷貝數變異檢測試劑盒和所述模板DNA制備反應混合液，并將所述混合液上樣于芯片中，進行ddPCR反應；

將ddPCR反應后的芯片置于數據采集系統上，采集FAM熒光信號和HEX熒光信號；

計算FAM熒光信號與HEX熒光信號的比值，即得所述PTPN22基因拷貝數。

7.根據權利要求6所述的PTPN22基因拷貝數變異檢測方法，其特征在于，ddPCR的反應體系為：

8.根據權利要求7所述的PTPN22基因拷貝數變異檢測方法，其特征在于，所述ddPCR的反應程序為：4℃預變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共進行35個循環，72℃再延伸5min，12℃終止反應。

9.根據權利要求6至8任一項所述的PTPN22基因拷貝數變異檢測方法，其特征在于，所述提取模板DNA包括如下步驟：

采集抗凝血液置于滅菌離心管，加入磷酸緩沖液混勻，多次離心和再溶解至上清液透明、沉淀呈透明色；

向離心管中加入DNA抽提緩沖液，37℃水浴；再加蛋白酶K，混勻，55℃水浴中消化過夜至絮狀沉淀不見，得澄清溶液；

將所述澄清溶液冷卻，加入Tris飽和酚溶液，混勻，離心，將上層水相轉入另一滅菌離心管，再加入氯仿，混勻，離心，將上層水相轉入另一滅菌離心管，再加入氯仿異戊醇混合液(V_氯仿:V_異戊醇＝24:1)，混勻，離心，再將上層水相轉入另一滅菌離心管，加入預冷無水乙醇使DNA呈絮狀沉淀，離心，棄去乙醇，向下層沉積中再加入預冷70％乙醇，離心，多次漂洗DNA沉淀，離心棄上清液，室溫下使下層DNA沉積中的乙醇揮發干凈；

再向下層DNA沉積中加入TE緩沖液溶解DNA，4℃保存，直至DNA完全溶解，得模板DNA。

10.根據權利要求9所述的PTPN22基因拷貝數變異檢測方法，其特征在于，所述模板DNA的濃度大于50ng/μL。