[發(fā)明專利]一種檢測人MUT基因突變的引物組及其試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010090251.9
• 申請日: 2020-02-13
• 公開（公告）號: CN111088348A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王世富;裴鳳艷;李政;李靜;寇琳娜;于文文;班傳偉;魯艷芹
• 申請（專利權(quán)）人: 濟(jì)南市兒童醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

本發(fā)明提供一種用于檢測MUT基因突變的引物組，該引物組包括13對特異性擴(kuò)增MUT基因第1至第13外顯子的引物；本發(fā)明采用特異性引物組，針對MUT基因的第1到第13外顯子進(jìn)行突變檢測，確保了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性與特異性。與傳統(tǒng)的單一突變位點(diǎn)的檢測而言，擴(kuò)大了檢測突變范圍至MUT外顯子區(qū)所有位點(diǎn)，覆蓋已報(bào)道的突變位點(diǎn)與可能的突變位點(diǎn)。與傳統(tǒng)的通過熒光定量PCR采用探針法檢測相比，降低了檢測成本，同時PCR產(chǎn)物通過DNA序列測定以及后續(xù)序列比對完成，其準(zhǔn)確性要高于熒光定量PCR。與高通量測序相比較，直接對MUT致病基因進(jìn)行檢測，避免了高通量測序中因原始數(shù)據(jù)篩選、閾值設(shè)定等問題而可能出現(xiàn)的假陽性與假陰性問題；同時節(jié)省了成本與人力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及檢測人MUT基因突變的引物組及其試劑盒，具體涉及MUT基因突變所導(dǎo)致的甲基丙二酸血癥(methylmalonic academia，MMA)的基因檢測，屬于兒童遺傳代謝性疾病基因檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

甲基丙二酸血癥(methylmalonic academia，MMA)在我國是一種常見的有機(jī)酸血癥，主要是由于甲基丙二酰輔酶A變位酶(methylmalonyl-CoA mutase，MCM)自身缺陷或其輔酶腺苷鈷胺素代謝缺陷，導(dǎo)致患者體內(nèi)甲基丙二酸、甲基枸櫞酸、3-羥基丙酸等代謝產(chǎn)物蓄積引起的疾病。該病病因復(fù)雜，主要包括甲基丙二酰輔酶A變位酶酶蛋白(mutaseapoenzyme,Mut)缺陷型及其輔酶腺苷鈷胺素(cobalamin，Cbl，維生素B12)缺陷型，均為常染色體隱性遺傳病。MCM缺陷型根據(jù)酶的殘余活性可分為mut⁰型(完全無活性)及mut^-型(有殘余活性者)，腺苷鈷胺素代謝障礙包括：腺苷鈷胺素合成缺陷型，即線粒體鈷胺素還原酶缺乏(cblA)和鈷胺素腺苷轉(zhuǎn)移酶缺乏(cblB)；以及3種由于胞漿和溶酶體鈷胺素代謝異常引起的腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素合成缺陷型(cblC、cblD和cblF)。其中mut⁰，mut-，cblA和cblB型患者臨床表現(xiàn)類似，僅表現(xiàn)甲基丙二酸血癥，通常稱為單純型MMA。cblC，cblD，cblF型患者則合并同型半胱氨酸血癥，是中國MMA患者中的常見類型。

甲基丙二酸血癥發(fā)病年齡各異，新生兒期至成人期均可發(fā)病，且臨床癥狀復(fù)雜多樣，缺乏特異性，伴有多種并發(fā)癥，極易誤診。新生兒期患兒臨床表現(xiàn)主要為嘔吐、喂養(yǎng)困難、嗜睡、驚厥等，并發(fā)癥主要表現(xiàn)為腦損傷、合并肺炎等疾病。與甲基丙二酸尿癥合并同型半胱氨酸血癥相比，單純型MMA患者病情多數(shù)更為嚴(yán)重，起病急，發(fā)病快，且早期臨床癥狀僅表現(xiàn)為非特異性，如拒奶，嘔吐，嗜睡等，但疾病進(jìn)展迅速，可導(dǎo)致嚴(yán)重性腦損傷，代謝性酸中毒，死亡率高，且預(yù)后不良。有研究顯示，相較于其他甲基丙二酸血癥類型，單純性甲基丙二酸血癥患兒多為早發(fā)型，多于1歲內(nèi)發(fā)病，80％在出生后一周內(nèi)就會出現(xiàn)癥狀，90％在一個月內(nèi)出現(xiàn)癥狀。同時癥狀較重，腦損傷多累及雙側(cè)蒼白球，且多數(shù)經(jīng)維生素B12治療無效，體內(nèi)有機(jī)酸水平及丙酰基肉堿水平并無明顯降低，預(yù)后較差，智力落后等并發(fā)癥及死亡率極高。已有報(bào)道顯示mut⁰型預(yù)后最差，60％患兒死亡，而40％各方面發(fā)育均顯著遲緩^[20-23]。遲發(fā)型較為罕見，常于1歲后發(fā)病，臨床表型顯示非特異性，癥狀較輕，且預(yù)后較好。

甲基丙二酰輔酶A變位酶編碼基因被命名為MUT(OMIM251000)，定位于染色體6p21.2-p12，由13個外顯子組成，編碼750個氨基酸。至今已發(fā)現(xiàn)MUT基因突變200余種，其中多為錯義突變，且多見于外顯子2和3。國外報(bào)道該病的患病率約為1/80000～1/50000，我國目前還沒有發(fā)病率的整體研究。對由MUT基因引起的單純型甲基丙二酸血癥患者的臨床癥狀進(jìn)行總結(jié)分析，以期發(fā)現(xiàn)基因型和表型的相關(guān)型，豐富MUT基因突變譜，對MCM型患者早期診斷提供幫助。目前甲基丙二酸血癥MUT基因突變的報(bào)道很少，這里針對該基因進(jìn)行了突變引物設(shè)計(jì)及其相應(yīng)基因突變檢測試劑盒的研發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供檢測人MUT基因突變的引物組及其試劑盒。