[發明專利]基于CRISPR技術的2019-nCoV快速檢測引物組及其用途

有效

• 申請號: 202010088777.3
• 申請日: 2020-02-12
• 公開（公告）號: CN111363847B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 許騰;曾偉奇;楊敏玲;陳文景;徐學中;李永軍;王小銳;蘇杭
• 申請（專利權）人: 廣州微遠醫療器械有限公司;廣州微遠基因科技有限公司;廣州微遠醫學檢驗實驗室有限公司;深圳微遠醫療科技有限公司;微遠（深圳）醫學研究中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 李海恬

本發明涉及一種基于CRISPR技術的2019?nCoV快速檢測引物組及其用途，屬于CRISPR技術的基因檢測技術領域。該引物組包括：Orf1ab基因擴增引物對和Orf1ab基因crRNA，N基因擴增引物對和N基因crRNA。采用該引物組以CRISPR技術檢測2019?nCoV，縮短了2019?nCoV的檢測時間，可在40?60min內完成檢測。本發明通過篩選得到了特定的序列組合作為引物組進行檢測，具有靈敏性高、特異性強的優勢，其檢測限可達7.5copies。并且采用該引物組對2019?nCoV進行CRISPR檢測，擺脫了對qPCR儀等復雜變溫擴增儀器的依賴，使得CRISPR?Cas技術在2019?nCoV的即時診斷方面具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及基于CRISPR技術的基因檢測技術領域，特別是涉及一種基于CRISPR技術的2019-nCoV快速檢測引物組及其用途。

背景技術

冠狀病毒是一大類RNA病毒，目前已知的可感染人的冠狀病毒共七種。其中四種冠狀病毒，包括Human coronavirus 229E，Human coronavirus OC43，Human coronavirusNL63，Human coronavirus HKU1在人群中較為常見，但致病性較低，一般僅引起類似普通感冒的輕微呼吸道綜合癥狀。另外兩種嚴重急性呼吸綜合征病毒(SARS)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS) 可引起嚴重的呼吸系統疾病。2019-nCoV是目前發現的第七種可感染人的冠狀病毒。

2019-nCoV是一種類似于MERS和SARS的β冠狀病毒，它們都起源于蝙蝠。2019-nCoV的潛伏期為1～14天，主要癥狀為發熱，多為38℃的高燒，少數為37.5℃的低燒，個別病例甚至無發熱癥狀。在最初患病住院的40多人當中，病死率高達15％，重癥監護的比例超過30％，都已經超過了SARS的水平。但是如果綜合考慮更多癥狀輕微的患者的話，綜合病死率目前在3％左右，低于SARS(10％)和MERS(35％)的水平。

考慮到2019-nCoV有較強的感染與傳播能力，如何實現對其快速準確的診斷，從而對感染病患實現有效的隔離防治，保障公共衛生安全是目前最為重要緊迫的事情。因此，一種針對2019-nCoV有效的快速、靈敏、準確的檢測方法急需建立。

重組酶-聚合酶擴增(RPA)是一種快速興起的恒溫擴增技術，通過能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和具有鏈置換功能的DNA聚合酶，在室溫(最適反應溫度為37℃～42℃)下即可獲得可檢測級別的擴增核酸，并且通過加入逆轉錄酶(RT酶)，可以實現對模板RNA的擴增。但是，原理上其單級擴增反應的本質并未改變，相較于目前市場上多數的qPCR檢測方式，并無實質性的靈敏度提升。

發明內容

基于此，有必要針對上述問題，提供一種基于CRISPR技術的2019-nCoV快速檢測引物組及其用途，采用該引物組以CRISPR技術檢測2019-nCoV，能夠針對2019-nCoV傳播廣，傳播快的特點，進行特異、靈敏、簡易、快速的現場檢測，有助于臨床診斷。

一種基于CRISPR技術的2019-nCoV快速檢測引物組，包括：Orf1ab基因擴增引物對和 Orf1ab基因crRNA，N基因擴增引物對和N基因crRNA；所述Orf1ab基因擴增引物對和N 基因擴增引物對分別用于擴增2019-nCoV如SEQ ID NO.1所示Orf1ab基因序列和SEQ ID NO.2所示N基因序列；所述Orf1ab基因crRNA和N基因crRNA均包括錨定序列和向導序列，錨定序列與Cas蛋白特異性識別，Orf1ab基因crRNA的向導序列與所述SEQ ID NO.1 序列中的靶向序列片段相匹配，N基因crRNA的向導序列與所述SEQ ID NO.2序列中的靶向序列片段相匹配。

可以理解的，上述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列，以DNA序列為基礎，用以表示與該序列匹配對應的RNA序列，及該上述序列的互補序列等，均與上述SEQ ID NO.1和SEQID NO.2序列等同。