[發明專利]一種短小蛇根草色氨酸脫羧酶基因OpTDC2的克隆表達及應用

有效

• 申請號: 202010088611.1
• 申請日: 2020-02-12
• 公開（公告）號: CN111187785B
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 開國銀;尤大偉;馮岳;黃超;范三鵬;張通
• 申請（專利權）人: 浙江中醫藥大學
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12N15/70;C12Q1/527
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

本發明提供了一種短小蛇根草色氨酸脫羧酶基因OpTDC2的克隆表達及應用,并公開了其基因的核苷酸序列、氨基酸序列及其酶學性質,屬于生物工程技術領域。色氨酸脫羧酶OpTDC2可用于催化色氨酸脫羧形成色胺，其米氏常數K_m值為1.02mM。相比于其他植物來源的色氨酸脫羧酶，比如長春花(Catharanthus roseus)K_m為1.31mM，蘿芙木(Rauvolfia verticillate)K_m為2.89mM，印度人參(Withania Somnifera)K_m為1.49mM，我們的色氨酸脫羧酶OpTDC2具有更低的米氏常數，即對底物的親和力更強，催化效率更高，可以為合成生物學研究提供多樣性的底物來源，因此具有一定的應用價值。

技術領域

本發明涉及一種短小蛇根草色氨酸脫羧酶基因OpTDC2的克隆表達及應用，并公開了其基因的核苷酸序列、氨基酸序列、其酶學性質，屬于生物工程技術領域。

背景技術

色氨酸脫羧酶(Tryptophan decarboxylase，EC 4.1.1.28,TDC)可以催化色氨酸脫羧形成色胺，是喜樹堿合成過程中連接初生代謝和次生代謝的關鍵酶。

色氨酸脫羧酶最早是見于藥用植物長春花中進行報道，并且在多種植物中均有發現。

色氨酸脫羧酶屬于裂解酶類，具有較高的底物特異性，對類似的芳香族氨基酸如酪氨酸，苯丙氨酸等沒有脫羧作用。

先前的研究表明，色氨酸脫羧酶基因在陸生植物中往往以多基因家族形式存在。例如，Melina等人于1997年在喜樹中分離和鑒定了兩條色氨酸脫羧酶基因；Pang等人對西紅柿中全部5條色氨酸脫羧酶基因進行了功能解析；Kang等人通過生物信息的手段證明水稻中含有七條色氨酸脫羧酶基因及其類似物。

然而截止目前為止，短小蛇根草中的色氨酸脫羧酶見于報道的只有一條。這一現象與其多基因家族存在這一事實不符。

因此，本發明利用本實驗室短小蛇根草的轉錄組數據，從實驗室溫室培養的短小蛇根草無菌苗中分離和鑒定出一條新的色氨酸脫羧酶基因，并將其命名為OpTDC2。利用大腸桿菌進行異源重組表達蛋白OpTDC2以驗證其活性，并對其進行Ni-柱親和純化以及酶學性質研究。

發明內容

本發明目的在于從藥用植物短小蛇根草無菌苗中分離和鑒定了一條新的色氨酸脫羧酶基因OpTDC2，利用大腸桿菌進行異源重組表達蛋白OpTDC2，并公開了其酶學性質及其應用。

本發明采用的技術方案是：

一種短小蛇根草色氨酸脫羧酶基因OpTDC2，所述色氨酸脫羧酶基因OpTDC2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一種上述的色氨酸脫羧酶基因OpTDC2的克隆表達方法，通過將色氨酸脫羧酶基因OpTDC2構建至原核表達載體pCold TF中得到重組質粒pCold TF-OpTDC2，并將陽性重組質粒pCold TF-OpTDC2轉入BL21(DE3)感受態細胞中組成重組菌株。重組菌株在誘導劑IPTG的誘導下表達出可溶性蛋白OpTDC2。所述重組質粒pCold TF-OpTDC2的序列如SEQ ID NO.4所示，其中原核表達載體pCold TF的序列如SEQ ID NO.3所示。其中，構建重組質粒pCold TF-OpTDC2時，先提取短小蛇根草無菌苗全基因組RNA，并將其反轉錄獲得全基因組cDNA。設計色氨酸脫羧酶基因OpTDC2的特異性引物，擴增得到色氨酸脫羧酶基因OpTDC2全長編碼框序列，將擴增得到的色氨酸脫羧酶基因OpTDC2全長編碼框序列與雙酶切后的pCold TF質粒片段進行同源重組連接從而構建得到重組表達質粒pCold TF-OpTDC2。

一種上述可溶性蛋白OpTDC2在色氨酸催化反應中的應用。