[發(fā)明專利]一種用于DNA測序的通道結(jié)構(gòu)及其制備和測序的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010088307.7
• 申請日: 2020-02-12
• 公開（公告）號: CN111154848A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王德強;梁麗媛;王森;唐婧;蔡瑤;翁婷;周碩;周大明;殷博華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京元本知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11308
• 代理人: 黎昌莉

本發(fā)明屬于DNA測序技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于DNA測序的通道結(jié)構(gòu)及其制備方法和應(yīng)用。所述通道結(jié)構(gòu)為DNA折紙與固態(tài)納米孔的復(fù)合通道結(jié)構(gòu)。所述通道結(jié)構(gòu)能減小通道的有效厚度，從而大大提高通道在單分子檢測中的空間分辨率，同時也能解決固態(tài)納米孔不規(guī)整的內(nèi)表面形貌和不均勻的電荷分布帶來的測試低頻噪音干擾，為DNA測序設(shè)備提供穩(wěn)定高靈敏的核心檢測部件，且所述復(fù)合通道結(jié)構(gòu)具有很好的穩(wěn)定性，用于DNA測序，具有較高的準確度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于DNA測序技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于DNA測序的通道結(jié)構(gòu)及其制備方法和用于測序的方法。

背景技術(shù)

納米孔電學(xué)檢測作為單分子檢測新手段能給一些生物大分子結(jié)構(gòu)分析帶來傳統(tǒng)檢測手段達不到的精度與靈敏度，尤其是面向未來DNA測序的穩(wěn)定可靠國產(chǎn)測序裝置的研發(fā)與應(yīng)用。但現(xiàn)在納米孔主打的兩種載體材料無論是生物蛋白還是無機有機薄膜，都存在各自的優(yōu)勢與不足。后續(xù)發(fā)展的將兩者結(jié)合的新型復(fù)合納米孔，也依然存在信噪比不高，漏電流大，復(fù)合孔壽命不長等缺陷。DNA折紙作為新型的DNA多級組裝結(jié)構(gòu)能通過組裝媒介和DNA濃度等參數(shù)調(diào)控，得到形貌、強度和性能多樣的組裝體與不同體系進行集成，從而實現(xiàn)多功能化的應(yīng)用拓展。

近來也有報道采用DNA折紙結(jié)構(gòu)嵌入磷脂雙層，構(gòu)筑仿生離子通道或生物大分子檢測平臺，這個復(fù)合器件面臨與生物納米孔同樣的問題，就是脂質(zhì)層受外界環(huán)境影響而不穩(wěn)定。后續(xù)也有將DNA折紙通過一個單鏈牽引在電場驅(qū)動下嵌入固態(tài)納米孔中，形成復(fù)合納米通道，但通道的空間分辨率仍受折紙結(jié)構(gòu)的限制。為了克服以上缺陷，本發(fā)明重新設(shè)計了DNA折紙，構(gòu)筑了新型的DNA折紙與固態(tài)納米孔復(fù)合結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于提供所述用于DNA測序的通道結(jié)構(gòu)的制備方法，所述制備方法可有效制備所述通道結(jié)構(gòu)，且時間較短，穩(wěn)定性強。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下方案：

所述用于DNA測序的通道結(jié)構(gòu)的制備方法，包括以下步驟：

1)固態(tài)納米孔的制備：在硅基氮化硅薄膜上利用電流脈沖擊穿的方式制備；

具體的，在帶有10μm²窗口的硅基氮化硅薄膜上，采用電導(dǎo)液(1M KCl、10mM Tris、1mM EDTA)利用電流脈沖擊穿的方式制備直徑為10-15nm的孔道，并在上述電導(dǎo)液中通過膜片鉗測定IV曲線，由經(jīng)驗公式計算納米孔的直徑。

2)固態(tài)納米孔的活化：將步驟1)的固態(tài)納米孔清洗后浸泡于食人魚洗液再清洗烘干；

具體的，將負載有納米孔的氮化硅基片用有機溶劑及水清洗后烘干，然后用功率20-30w的等離子體清洗氮化硅薄膜數(shù)分鐘，再在食人魚洗液(硫酸和雙氧水體積比3：1)中室溫浸泡30分鐘，水洗數(shù)次去除酸液后，將納米孔基片在100℃下烘干數(shù)分鐘，以此增加納米孔的親水性，有利于后續(xù)與DNA孔復(fù)合。

3)DNA折紙的制備與表征：通過staple序列與核心序列的設(shè)計，在含有鎂離子的緩沖體系中通過調(diào)節(jié)溫度和DNA濃度多步逐級組裝，構(gòu)筑底端與固態(tài)納米孔尺寸嵌合，且上面交錯部分留有2nm有效厚度的納米孔，并在正立方體DNA折紙通道設(shè)計ssDNA牽引序列，然后將DNA折紙通道溶液滴在碳膜銅網(wǎng)上，通過電鏡做形貌尺寸的表征，確定結(jié)構(gòu)符合設(shè)計需求；

4)DNA折紙與固態(tài)納米孔的復(fù)合通道結(jié)構(gòu)的制備：將DNA折紙加入電解液池的cis端，在外加偏壓驅(qū)使下，通過ssDNA牽引序列將DNA折紙定向插入固態(tài)納米孔內(nèi)。

具體的，Staple序列是將折紙結(jié)構(gòu)穩(wěn)定住，在一定的組裝條件下能固定組裝形態(tài)，人類基因組DNA中存在著許多重復(fù)單位在數(shù)個至數(shù)十個堿基對之間的串聯(lián)重復(fù)DNA,即小衛(wèi)星DNA。不同小衛(wèi)星DNA的重復(fù)單位雖不相同，但是均含有一個比較相似的、差異比較小的、富含G的序列，稱為核心序列或基序。核心序列就相當(dāng)于樂高里面的不同模塊，它主要決定會組裝成什么特定形貌。