[發(fā)明專利]一種體外誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向膀胱平滑肌細(xì)胞分化的細(xì)胞培養(yǎng)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010088289.2
• 申請(qǐng)日: 2020-02-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111269881A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣文凱;王迪雅;仇珺;孫書(shū)愷;張亞慶;宋冰;余擎;王勝朝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 北京匯捷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11531
• 代理人: 于鵬

1.一種體外誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向膀胱平滑肌細(xì)胞分化的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，該細(xì)胞培養(yǎng)方法包括如下步驟：

步驟(1)牙髓干細(xì)胞DPSCs的分離和培養(yǎng)；

步驟(2)膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs的分離和培養(yǎng)；

步驟(3)膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs條件培養(yǎng)液CM收集；

步驟(4)篩選膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)液；

步驟(5)體外誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞DPSCs向膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs方向分化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向膀胱平滑肌細(xì)胞分化的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的步驟(1)牙髓干細(xì)胞DPSCs的分離和培養(yǎng)包括如下步驟：

1)在無(wú)菌條件下，從脫落的牙齒中取出牙髓組織，將牙髓組織置于EP管中，加入1ml濃度為4μg/μl的Ⅰ型膠原酶，將EP管轉(zhuǎn)移至CO₂孵箱中進(jìn)行消化，每隔20min充分震蕩EP管，使牙髓組織與消化酶充分接觸；充分消化1h后，將EP管內(nèi)容物分別通過(guò)70μm的細(xì)胞篩，轉(zhuǎn)移至新的EP管中，以獲取單細(xì)胞懸液；利用PBS緩沖液充分漂洗細(xì)胞懸液后，待用；

2)利用纖維連接蛋白干細(xì)胞篩選法進(jìn)行牙髓干細(xì)胞DPSCs篩選：

將纖維連接蛋白溶于PBS緩沖液中，制備成濃度為10μg/ml包被液；將含有纖維連接蛋白的包被液滴加于6孔板中，每孔1ml，置于孵箱中過(guò)夜；轉(zhuǎn)天PBS緩沖液充分漂洗去未粘附的纖維連接蛋白后，晾干待用；

將上述獲得的DPSCs細(xì)胞懸液，滴加于纖維連接蛋白預(yù)包被的6孔板，其中，每孔40,000細(xì)胞，移至孵箱中孵育20min后，去除培養(yǎng)液及未粘附的細(xì)胞，重新加入2ml新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；每隔2天換一次液；待單克隆長(zhǎng)到至少32個(gè)細(xì)胞后，將1ml槍頭上端減去，留下圓柱狀的下端，下端涂上凡士林，在鏡下標(biāo)記出不同克隆，將制備好的槍頭下端置于克隆上，利用Accutase進(jìn)行消化后，傳至T25瓶中；分離培養(yǎng)出牙髓干細(xì)胞DPSCs。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向膀胱平滑肌細(xì)胞分化的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的步驟(2)膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs的分離和培養(yǎng)具體如下：將脫離人體的膀胱組織置于含有1％青霉素/鏈霉素的PBS中充分漂洗后，置于含有1000U/ml中性蛋白酶2的培養(yǎng)皿中，4℃過(guò)夜；12h后取出組織，用PBS緩沖液充分漂洗后，分離出平滑肌層組織，將平滑肌組織裁剪為1x1mm的小碎片，Ⅳ型膠原酶消化30min，置于37℃培養(yǎng)箱中，每隔10min充分震蕩一次，使Ⅳ型膠原酶和組織塊充分接觸；消化結(jié)束后，將細(xì)胞懸液通過(guò)70μm細(xì)胞篩過(guò)濾，重懸于含有質(zhì)量百分比濃度為10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2天換液一次；分離培養(yǎng)出膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向膀胱平滑肌細(xì)胞分化的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的步驟(3)膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs條件培養(yǎng)液CM收集具體如下：將步驟(2)的膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs置于含有質(zhì)量百分比濃度為10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行常規(guī)的培養(yǎng)，傳代至第8代；當(dāng)細(xì)胞增殖至70％-80％融合后，更換為含有質(zhì)量百分比濃度為15％FBS的α-MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h；收集培養(yǎng)液，1500rpm離心5min后，將培養(yǎng)液通過(guò)40μm過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，該培養(yǎng)液為膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs條件培養(yǎng)液CM。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向膀胱平滑肌細(xì)胞分化的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的步驟(4)篩選膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)液為：膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)液質(zhì)量百分比濃度為含有20％膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs條件培養(yǎng)液CM，2.5ng/ml生長(zhǎng)因子TGF-β1和15％FBS的DMEM培養(yǎng)液作為最終誘導(dǎo)液。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向膀胱平滑肌細(xì)胞分化的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的步驟(5)體外誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞DPSCs向膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs方向分化具體如下：將含有質(zhì)量百分比濃度為20％膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs條件培養(yǎng)液CM，15％FBS的DMEM培養(yǎng)液與含有2.5ng/ml生長(zhǎng)因子TGF-β1，15％FBS的DMEM按1:1比例進(jìn)行混合，配置為膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)液；

將步驟(1)的牙髓干細(xì)胞DPSCs的第8代細(xì)胞以1x105cells/ml接種于6孔板中，每孔2ml，常規(guī)培養(yǎng)24h至細(xì)胞貼壁后，換上述配置的膀胱平滑肌細(xì)胞SMCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)液，進(jìn)行誘導(dǎo)。