[發(fā)明專利]一種核酸固載微球的制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010087598.8 | 申請日： | 2020-02-12 |
| 公開（公告）號： | CN111171229B | 公開（公告）日： | 2021-12-28 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 段海峰;劉海濤;喬朔;康力;陳子天 | 申請（專利權(quán)）人： | 賽納生物科技(北京)有限公司 |
| 主分類號： | C08F220/56 | 分類號： | C08F220/56;C08F220/60;C08F222/38;C08F8/48;C08F4/04;B01J13/14 |
| 代理公司： | 北京嘉途睿知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11793 | 代理人： | 彭成 |
| 地址： | 100176 北京市大興*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 核酸 固載微球 制備 方法 | ||
本發(fā)明提供一種核酸固載微球的制備方法，可以有效固載核酸分子。該方法包括如下步驟,將水溶性功能性丙烯酰胺疊氮單體、丙烯酰胺單體、N,N?亞甲基雙丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮溶于異丙醇和水混合溶劑中；加入自由基引發(fā)劑，加熱從室溫升至70?90℃，經(jīng)聚合反應(yīng)即得到目標功能性聚合物微球；聚合物微球通過可反應(yīng)性疊氮基團與炔基核酸分子反應(yīng)，可有效實現(xiàn)核酸固載于微球上。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種核酸固載微球的制備方法，可以有效固載核酸分子，屬于基因測序領(lǐng)域。
背景技術(shù)
生物活性負載性微球(Microsphere)為粒徑在50nm～2mm之間的球形顆粒，帶有反應(yīng)性基團如-NH 2，-COOH，-SH等。微球由于具有較小的尺寸而致使其具有明顯的表面效應(yīng)如材料的親和性好、生物相容性好、以及在生物體內(nèi)易吸收、易游走等特性，已廣泛的應(yīng)用于細胞學、免疫學、微生物學、分子生物學以及臨床診斷與治療以及高通量基因檢測等眾多領(lǐng)域。
在微球用于高通量基因檢測分析某些核酸序列的方法中，依賴于微球的尺寸分布在1μm左右、高度均勻分散以及微球?qū)τ诤怂徭湹呢撦d量。然后，可通過本領(lǐng)域公知的許多不同的方法來確定負載的核酸鏈的序列。
在某些微球用于核酸測序方法中，程序包括用帶測序的核酸樣本通過領(lǐng)域內(nèi)公知的許多方法與微球相應(yīng)的反應(yīng)基團快速高效結(jié)合，實現(xiàn)負載；將負載核酸的微球引入流動池的通道中，并進入相應(yīng)的反應(yīng)微坑道，孵育固定的時間，產(chǎn)生始終能夠支持擴增和測序在內(nèi)的所有下游化學處理步驟。相比于其他類型的核酸負載體方法，如芯片涂覆負載性包被，核酸負載性微球具有更好的可控性，核酸負載量大等優(yōu)勢。
本發(fā)明提供一種核酸固載微球的制備方法，可以有效固載核酸分子。本發(fā)明所述的核酸固載微球單一性好，核酸固載量大，有利于基因測序等方面的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明提供一種核酸固載微球的制備方法，包括如下步驟：
(1)將丙烯酰胺單體、功能性丙烯酰胺單體、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺溶于異丙醇和水混合溶劑中，并攪拌均勻；
(2)向步驟(1)的體系中加入水溶性分散劑聚乙烯吡咯烷酮，并攪拌均勻；所述的聚乙烯吡咯烷酮與丙烯酰胺單體質(zhì)量比為0.05～0.5；
(3)向步驟(2)的體系中加入自由基引發(fā)劑4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)，所述的自由基引發(fā)劑4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)與丙烯酰胺單體質(zhì)量比 0.01～0.1；
(4)加熱步驟(3)的體系至70-90℃，經(jīng)聚合反應(yīng)即得到粒徑0.5～5微米、粒徑CV小于0.4的功能性單分散水凝膠聚合物微球；
(5)聚合物微球通過“點擊”化學固載核酸分子；所述的“點擊”化學指的是銅催化的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)，所用催化劑為硫酸銅與三(3-羥丙基三唑甲基)胺的絡(luò)合物(Cu-THPTA)，其中催化劑與功能性丙烯酰胺疊氮單體摩爾比為 1～100。
根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述步驟(1)中混合溶劑中異丙醇和水質(zhì)量比為 1:0～1:0.1。
根據(jù)優(yōu)選的實施方式，步驟(1)中，所述的功能性丙烯酰胺單體是指：1) 具有疊氮基團能用來固載核酸的甲基丙烯酰胺疊氮單體，所述的甲基丙烯酰胺疊氮單體與丙烯酰胺單體質(zhì)量比為0.1～0.5；2)具有生物素基團能用來實現(xiàn)微球固載的丙烯酰胺生物素單體，所述的丙烯酰胺生物素單體與丙烯酰胺單體質(zhì)量比為0.01～0.05。
根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述步驟(1)中混合溶劑為異丙醇、乙醇、乙腈和水的混合溶劑，優(yōu)選異丙醇和水的混合體系，異丙醇和水的體積比為4～9。
根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述步驟(4)中微球粒徑特征區(qū)間在0.5-3um。
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