[發(fā)明專利]陽離子多聚體DNA復(fù)合物及促進(jìn)目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及表達(dá)的方法

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• 申請日: 2020-02-11
• 公開（公告）號: CN111154805A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邵嘉紅;譚靚;談鵬程;李泰明
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州吉恒基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 南京利豐知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32256
• 代理人: 王茹;王鋒

本發(fā)明公開了一種陽離子多聚體DNA復(fù)合物及促進(jìn)目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及表達(dá)的方法。所述陽離子多聚體DNA復(fù)合物是由輔助DNA與帶正電荷的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑孵育形成。所述方法包括：以包含目標(biāo)基因的質(zhì)粒、輔助DNA與陽離子多聚體共孵育后共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；或者，先以包含目標(biāo)基因的質(zhì)粒和輔助DNA中的任意一者與陽離子多聚體共孵育后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，再在設(shè)定時(shí)間內(nèi)以另一者與陽離子多聚體共孵育后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。本發(fā)明的利用陽離子多聚體DNA復(fù)合物促進(jìn)目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及表達(dá)的方法能高效提高陽離子多聚體遞送外源基因的能力并顯著提高外源目標(biāo)蛋白的表達(dá)量至少5倍以上，表明陽離子多聚體DNA復(fù)合物能夠作為轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑促進(jìn)目標(biāo)質(zhì)粒的表達(dá)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種促進(jìn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及表達(dá)的方法，具體的，尤其涉及一種利用陽離子多聚體DNA復(fù)合物促進(jìn)目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及表達(dá)的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

基因遞送是指將外源特定基因通過適合的方式導(dǎo)入到靶細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)出特定蛋白的過程，它作為基因工程的重要環(huán)節(jié)之一，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程和酶工程等領(lǐng)域中，例如重組蛋白質(zhì)的開發(fā)和生產(chǎn)、傳統(tǒng)蛋白質(zhì)和酶的規(guī)?；a(chǎn)與制備等；除此之外，它也被應(yīng)用于一些生物藥品的制備中，例如生物疫苗的制備、特定生物多肽和蛋白質(zhì)藥物的制備等。基因遞送的關(guān)鍵在于載體的選擇，目前，用于基因遞送的載體主要分為病毒載體和非病毒載體。非病毒載體主要包括改性天然高分子和合成高分子兩大類。其中，改性天然高分子類主要包括一些脂質(zhì)類、多糖類和蛋白類載體；合成高分子類主要是指一些可以生物降解的聚陽離子性的高分子載體。非病毒載體具有無傳染性、來源廣、材料易得、裝載容量大、操作簡便和可大量制備等優(yōu)點(diǎn)，因此在工業(yè)化生產(chǎn)中被廣泛運(yùn)用于大量制備酶或蛋白質(zhì)。非病毒載體作為基因遞送的載體之一，具有無傳染性、來源廣、裝載容量大、操作簡便和可大量制備等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)酶或其它蛋白質(zhì)。但由于非病毒載體有限的使用量和轉(zhuǎn)染效率，在一定程度上限制了其應(yīng)用。其中，聚乙烯酰胺(PEI)因其較高效的轉(zhuǎn)染效率已成為了目前基因遞送的常用非病毒載體之一，它是分子量在200Da至1500kDa左右的合成高分子材料，主要有分支狀和線性兩種結(jié)構(gòu)形式，其中分子量更小的線性PEI具有更加優(yōu)良的遞送效果。轉(zhuǎn)染時(shí)，將線性PEI與待轉(zhuǎn)DNA分子共孵育，PEI通過形成表面帶有陽離子的球狀聚合物將DNA分子包裹入內(nèi)，與細(xì)胞膜表面的陰離子結(jié)合后將DNA分子遞送入細(xì)胞，并能通過質(zhì)子海綿作用進(jìn)行胞內(nèi)體逃逸，使外源質(zhì)粒免于被酶降解從而被順利遞送至細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)而高效表達(dá)。但在實(shí)際運(yùn)用當(dāng)中，PEI的轉(zhuǎn)染效率在某些細(xì)胞中十分有限，并且PEI本身具有一定細(xì)胞毒性，有限的添加劑量也在一定程度上影響了轉(zhuǎn)染效率。由此可見，運(yùn)送載體的局限性在一定程度上限制了基因遞送在各個(gè)領(lǐng)域上進(jìn)一步的應(yīng)用和發(fā)展，因此，本發(fā)明提出一種用于促進(jìn)質(zhì)粒表達(dá)的基因遞送增強(qiáng)試劑有利于推動(dòng)各相關(guān)領(lǐng)域的快速發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供一種陽離子多聚體DNA復(fù)合物以及利用陽離子多聚體DNA復(fù)合物促進(jìn)目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及表達(dá)的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。

為實(shí)現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種陽離子多聚體DNA復(fù)合物，它是由輔助DNA與帶正電荷的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑孵育形成。

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種利用陽離子多聚體DNA復(fù)合物促進(jìn)質(zhì)粒表達(dá)的方法，其包括：

以包含目標(biāo)基因的質(zhì)粒、輔助DNA與帶正電荷的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑共孵育后共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；

或者，先以包含目標(biāo)基因的質(zhì)粒和輔助DNA中的任意一者與帶正電荷的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑共孵育后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，之后再在設(shè)定時(shí)間內(nèi)以目標(biāo)基因的質(zhì)粒和輔助DNA中的另一者與帶正電荷的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑共孵育后轉(zhuǎn)染所述宿主細(xì)胞。

在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述方法包括：

將包含目標(biāo)基因的質(zhì)粒、輔助DNA與帶正電荷的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑共孵育后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；