[發(fā)明專利]一種破骨細(xì)胞前體和間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的基質(zhì)依賴型組織工程骨及其構(gòu)建方法在審
【權(quán)利要求書】：
1.一種破骨細(xì)胞前體和間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的基質(zhì)依賴型組織工程骨的構(gòu)建方法，其特征在于，將間充質(zhì)干細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體按10:1比例，種植于多孔骨支架材料上構(gòu)建組織工程復(fù)合體，再在體外加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12～14天，在-70～80℃冷凍48～72小時，凍干24小時～30小時，獲得基質(zhì)依賴型組織工程骨。
2.如權(quán)利要求1所述的一種破骨細(xì)胞前體和間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的基質(zhì)依賴型組織工程骨的構(gòu)建方法，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、外周血間充質(zhì)干細(xì)胞、臍血間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求2所述的一種破骨細(xì)胞前體和間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的基質(zhì)依賴型組織工程骨的構(gòu)建方法，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的一種破骨細(xì)胞前體和間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的基質(zhì)依賴型組織工程骨的構(gòu)建方法，其特征在于，所述多孔骨支架材料為脫細(xì)胞骨基質(zhì)或脫鈣骨基質(zhì)。
5.如權(quán)利要求4所述的一種破骨細(xì)胞前體和間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的基質(zhì)依賴型組織工程骨的構(gòu)建方法，其特征在于，所述多孔骨支架材料為脫鈣骨基質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1至5任一項所述的一種破骨細(xì)胞前體和間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的基質(zhì)依賴型組織工程骨的構(gòu)建方法，其特征在于，取脫鈣骨基質(zhì)支架材料，用DMEM培養(yǎng)基浸泡48小時，調(diào)節(jié)pH值為7.2；取第二代處于指數(shù)增長期的間充質(zhì)干細(xì)胞，用PBS洗滌后，用0.1wt％I型膠原酶溶液孵育1小時，再加入含0.25wt％胰酶與0.02wt％EDTA的溶液消化3～5分鐘，用含10wt％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌并重懸，與破骨細(xì)胞前體按照10:1進(jìn)行混合重懸；將細(xì)胞接種至前述處理后的脫鈣骨基質(zhì)支架材料上，使細(xì)胞懸液剛好浸潤支架材料且不溢出支架材料之外；3小時后在無菌操作條件下將脫鈣骨基質(zhì)支架材料的底面翻轉(zhuǎn)變成頂面，同前述方法接種細(xì)胞懸液；細(xì)胞支架0.5cm×0.5cm×0.3cm規(guī)則大小，種植細(xì)胞總數(shù)大約106，3小時后加入DMEM培養(yǎng)基至剛好沒過脫鈣骨基質(zhì)支架材料的頂面，再在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)；24小時后，在體外對其進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)12～14天；在-70～80℃冷凍48～72小時，凍干24小時～30小時，冷凍保存3個月以顯著降低免疫原性，形成基于破骨細(xì)胞前體和間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的基質(zhì)依賴型組織工程骨。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種破骨細(xì)胞前體和間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的基質(zhì)依賴型組織工程骨的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的破骨細(xì)胞前體來自于經(jīng)100ng/ml的RANKL與50ng/ml的M-CSF破骨方向誘導(dǎo)分化24小時的骨髓單核細(xì)胞。
8.采用權(quán)利要求1～7任一項所述方法構(gòu)建的一種破骨細(xì)胞前體和間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的基質(zhì)依賴型組織工程骨。
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