[發明專利]一種抗胰蛋白酶的胞外水解酶及其應用

有效

• 申請號: 202010084765.3
• 申請日: 2020-02-10
• 公開（公告）號: CN111172134B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 谷立川;蘇甜甜;何靜;劉世恒;李寧娜
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;A61K38/47;A61P31/04
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

本發明公開了一種抗胰蛋白酶的胞外水解酶，該酶命名為PslG_K286A/K433S蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明還公開了所述酶在抑制細菌生物被膜形成中的應用和在瓦解已形成的細菌生物被膜中的應用。實驗證實：與現有野生型PslG蛋白相比，本發明的酶對胰蛋白酶的耐受程度顯著增強，IC₅₀提升了近10倍；在相同實驗條件下添加胰蛋白酶時，本發明所述的酶抑制微生物生物被膜形成的效果與野生型PslG相比顯著提高，表現出了更強的胰蛋白酶耐受性。預示本發明所述的酶能更好地應用于復雜的臨床環境，市場前景廣闊。

技術領域

本發明屬于微生物及基因工程技術領域，具體涉及一種抗胰蛋白酶的胞外水解酶及其在抗胰蛋白酶抑制/瓦解微生物生物被膜中的應用。

背景技術

生物被膜與人類密切相關，在臨床上往往引起很難治愈的慢性感染。這主要是因為細菌一旦形成生物被膜，對抗菌藥物的抗藥性與游離狀態相比會增加成百上千倍，并能夠更容易地逃避宿主的免疫反應，因而大大增加了治療的難度。細菌生物被膜引起的感染主要有兩種：一種是生物醫學材料相關感染，如導管、插管、生物材料移植物相關感染；另一種是細菌生物被膜疾病，如肺囊性纖維化、慢性骨髓炎等。而目前臨床上還缺乏能夠有效、穩定地抑制或瓦解銅綠假單胞菌等微生物的生物被膜的制劑和方法。

最近的臨床實驗表明銅綠假單胞菌自身產生的胞外水解酶PslG可以用來治療豬和小鼠的傷口感染，大幅提高抗生素的療效，預示將來可將PslG用于臨床上治療生物被膜引起的感染。然而，PslG可能使用的環境中存在大量的蛋白酶，尤其是胰蛋白酶類蛋白酶，這些酶的存在會嚴重抑制PslG的活性。研究表明人類基因組中有約2％的基因編碼蛋白酶，其中一大部分是胰蛋白酶類。此外，銅綠假單胞菌自身也可以分泌多種胞外蛋白酶，其中也包括胰蛋白酶類蛋白酶，這些嚴重限制了PslG的應用。因此，迫切需要開發能抗胰蛋白酶的胞外水解酶。檢索發現有關抗胰蛋白酶的胞外水解酶及其在抗胰蛋白酶抑制/瓦解微生物生物被膜中的應用的專利還未見報道。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種抗胰蛋白酶的胞外水解酶及其在抗胰蛋白酶抑制/瓦解微生物生物被膜中的應用。

本發明所述的抗胰蛋白酶的胞外水解酶，其特征在于：所述酶的相應氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明所述的抗胰蛋白酶的胞外水解酶的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一種制備上述抗胰蛋白酶的胞外水解酶蛋白的方法，其特征在于：將SEQ ID NO.2基因的核苷酸序列連接表達載體PGL01，然后轉化E.coli BL21(DE3)進行IPTG誘導表達，用Ni-NTA親和層析、Source 15Q陰離子交換層析及Superdex 200 10/300GL分子排阻層析方法純化得到蛋白。

本發明所述抗胰蛋白酶的胞外水解酶在對胰蛋白酶的耐受程度研究中的應用。

本發明所述抗胰蛋白酶的胞外水解酶在抑制細菌生物被膜形成中的應用。

本發明所述抗胰蛋白酶的胞外水解酶在瓦解已形成的細菌生物被膜中的應用。

其中：所述細菌優選是銅綠假單胞菌。

本發明利用蛋白質三維結構分析與胰蛋白酶酶切串聯質樸分析相結合設計突變位點，并對突變體蛋白進行抗胰蛋白酶酶切實驗，篩選得到具有抗胰蛋白酶特性的胞外水解酶(命名為PslG_K286A/K433S蛋白)。

實驗證實：與現有PslG蛋白相比，新得到的抗胰蛋白酶胞外水解酶蛋白PslG_K286A/K433S對胰蛋白酶的耐受程度顯著增強。PslG_K286A/K433S的IC₅₀(在所用實驗條件下37℃、30min水解50％起始PslG蛋白量所需的胰蛋白酶濃度)比已有的野生型PslG提升了10倍。