[發明專利]用于美洲黑楊和小葉楊種間雜交子代的鑒別引物和鑒定方法

有效

• 申請號: 202010084061.6
• 申請日: 2020-02-07
• 公開（公告）號: CN113249509B
• 公開（公告）日: 2023-09-01
• 發明（設計）人: 戴曉港;尹佟明;薛良交;陳晨;吳懷通;房芝馨
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 徐樂

本發明涉及生物技術領域，具體而言，提供了一種用于美洲黑楊和小葉楊種間雜交子代的鑒別引物和鑒定方法。本發明提供的用于美洲黑楊和小葉楊種間雜交子代的鑒別引物，包括含有SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2的(a)引物對和/或含有SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4的(b)引物對。該鑒別引物擴增產物在美洲黑楊和小葉楊兩個物種中長度存在特異性，可單獨使用其中一對引物進行鑒定，兩對引物同時使用可以提高鑒別的準確性。此外，使用此引物進行鑒別可以直接排除花粉污染等造成的錯誤檢測結果。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種用于美洲黑楊和小葉楊種間雜交子代的鑒別引物和鑒定方法。

背景技術

楊樹是楊屬(Populus)樹種的統稱，楊樹具有生長快、成材早、產量高、易于更新等特點。雜交是林木遺傳育種中最常用且最有效的方法。楊樹的雜交已有100多年的歷史，并選育出一批速生、抗病蟲的優良品種而廣泛應用于林業生產。雜交育種仍然是目前及今后更長時間培育楊樹新品種的重要手段。遠緣雜交可以把親本雙方的基因組整體融合，即把一個基因組有利性狀的基因導入到另外一個樹種中去，可以培育出速生、抗病蟲、抗逆性強的新品種。種間雜交授粉過程中，由于室外套袋授粉容易引起種內花粉的污染，而楊樹的選育周期較長，因此對楊樹苗期雜交子代的真實性鑒定，對楊樹種間雜交速生、抗病蟲、抗逆等優良性狀品種的選育具有重要的意義。

目前，楊樹種間雜交子代鑒別技術主要有以下幾種。(1)形態學標記：缺點是自然突變等獲得具有特定形態特征所需的時間較長，遺傳表達不穩定，表型還容易受環境條件的影響，因此，簡便性和準確性遠遠不夠；(2)?細胞學標記：缺點是在楊樹細胞學研究方面，目前研究只在染色體數目和核型分析層面，沒有開發出對遠緣雜交子代鑒定的細胞學標記；(3)生化標記：缺點是由于翻譯后的修飾作用、組織特異性和發育的階段性，特別是多態性位點較少，以及染色方法使用放射性材料，電泳條件因酶而異需要逐個調整，且譜帶受材料和環境影響較大，鑒定結果不容易令人信服，因此其使用受到了一定的限制；(4)DNA分子標記：以植物DNA為研究對象，從植物基因組水平檢測特異性DNA片段的長度多態性，可以準確鑒定植物種、無性系以及品種，且檢測不受植物發育時間的限制，也避免環境變化對植物的影響，從而提高了鑒別的準確性。

DNA分子標記主要包括RFLP、RAPD、ISSR、AFLP、SSR和SNP這幾種。

RFLP標記具有共顯性的特點，能夠區別純合與雜合基因型，不受顯隱關系、環境條件和發育條件的影響，可以提供單個位點上的較完整的信息。然而RFLP分子標記技術在實際的推廣應用過程中仍然存在缺陷，標記數量少，其操作技術也較為復雜，采用的放射性標記對人體有害等缺點，因而很難被廣泛的應用于植物品種遺傳鑒別。

RAPD和ISSR都是顯性分子標記，由于引物是一段較短的隨機序列，因此擴增檢測結果容易受外源DNA污染的影響，擴增重復性和穩定性較差，從而嚴重影響鑒別結果的可靠性。

AFLP標記也是以PCR為基礎來檢測DNA限制性片段的長度多態性，結合了RFLP和RAPD兩種分子標記技術的特點，具有多態性高、重復性強等特點。根據孟德爾遺傳定律，AFLP標記可以用于種間雜交子代的鑒別。采用AFLP標記進行子代真實性鑒別時，首先需要將親本和子代的DNA進行酶切、然后連接接頭、預擴增和選擇性擴增等，最后需要采用毛細管電泳檢測，AFLP檢測操作復雜，耗時耗力。

SSR分子標記是一類由2～6核苷酸為串聯重復單位組成串聯重復序列，廣泛分布于動植物的基因組中。SSR標記主要具有數量豐富、呈共顯性遺傳、擴增的特異性高、重復性好等優點，在廣泛應用于植物的品種鑒別中。如張紅蓮(2010)等采用SSR對鵝掌楸屬及其雜種鑒定時，從176對引物中只篩選出了1對引物可用于鵝掌楸種間雜交子代的鑒定。物種特異性的SSR分子標記開發耗時耗力，而且效率很低。