[發(fā)明專利]用于H1N1亞型流感病毒遺傳進化譜系鑒別的熒光定量PCR引物和參考標(biāo)準(zhǔn)品

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010083272.8
• 申請日: 2020-02-08
• 公開（公告）號: CN111004869B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 叢彥龍;孫藝學(xué);連曉歡;張鵬舉;鄧效禹;丁雪梅;凌蒙蒙
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 王薇

1.一種用于非疾病診斷與治療為目的的H1N1亞型流感病毒遺傳進化譜系的鑒別方法，其特征在于：

(1)針對H1N1亞型流感病毒的4個遺傳進化譜系，即古典豬流感病毒譜系、季節(jié)性人流感病毒譜系、禽流感病毒譜系、歐亞類禽豬流感病毒譜系，分別篩選出可以用于遺傳進化譜系鑒別、只具有譜系內(nèi)特異性，而無譜系間交叉反應(yīng)的4對PCR鑒別引物；各譜系鑒別引物的序列如下；

1)古典豬流感病毒譜系

上游引物：5′-CARCAMATCCTAYATTAATG-3′，下游引物：5′-ATTTTCCAATTGTGATCGG-3′

2)季節(jié)性人流感病毒譜系

上游引物：5′-YACTGATTTCYAAGGAR-3′，下游引物：5′-GGTACRARCCATTC-3′

3)禽流感病毒譜系

上游引物：5′-AGTTGGGTCATCGAAG-3′，下游引物：5′-CTAGATTGAATRGAAGGA-3′

4)歐亞類禽豬流感病毒譜系

上游引物：5′-GCCTGAATGGAAAGAK-3′，下游引物：5′-GWAGATTGCYTTTCAAG-3′

各引物所處區(qū)域分別位于某一遺傳進化譜系HA基因核苷酸序列的相對保守區(qū)，且該區(qū)域的核苷酸序列與其他遺傳進化譜系HA基因的核苷酸序列存在明顯差異，同時保證絕大多數(shù)差異位點位于所設(shè)計引物的3’端，以降低非特異性PCR擴增出現(xiàn)的概率；

(2)該4對引物可以利用熒光定量PCR方法對H1N1亞型流感病毒的4個遺傳進化譜系進行特異性鑒別，具體如下：

1)根據(jù)H1N1亞型流感病毒HA基因遺傳進化樹的分析結(jié)果，從4個遺傳進化譜系中各選取一株病毒的HA全長基因序列，其GenBank注冊號分別為：MK159413、V01088、CY077076、KM028031，送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行基因合成，并與pEASY-T1?Simple載體連接；將4個遺傳進化譜系HA基因的重組質(zhì)粒分別命名為pEASY-T1-I、pEASY-T1-II、pEASY-T1-III、pEASY-T1-IV，以此作為熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)品；

2)所述的熒光定量PCR方法包括如下步驟：

①熒光定量PCR方法的反應(yīng)體系：

在熒光定量PCR八聯(lián)管中依次加入FastStart?Universal?SYBR?Green?Master(ROX)10μL，ddH₂O?8.75μL，濃度為10μM的上/下游引物各0.5μL，待鑒定毒株的cDNA?0.25μL，至終體積20μL；

②熒光定量PCR方法的反應(yīng)條件：

將步驟①的反應(yīng)體系置于熒光定量PCR儀中進行反應(yīng)，反應(yīng)條件：第一階段，95℃，2min；第二階段，95℃，15s；47℃，30s；40個循環(huán)；

③熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建：

將步驟1)中所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成5個不同的拷貝數(shù)，分別為10¹⁰copies/μL、10⁸copies/μL、10⁶copies/μL、10⁴copies/μL、10²copies/μL；將步驟2)①反應(yīng)體系中的“待鑒定毒株的cDNA”分別替換為5個不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)條件同步驟2)②；以不同拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以檢測到的每個拷貝數(shù)所對應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線；不同拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品測得的Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R²≥0.90，且5個不同拷貝數(shù)質(zhì)粒所對應(yīng)的Ct值≤35；

④結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：

a.陽性結(jié)果：當(dāng)待鑒定毒株cDNA的Ct值≤35，Ct值位于4條標(biāo)準(zhǔn)曲線中的其中一條，且出現(xiàn)擴增曲線和峰型單一的熔解曲線，則可以判定該毒株屬于擴增該毒株所用鑒別引物對應(yīng)的遺傳進化譜系；

b.陰性結(jié)果：陰性結(jié)果檢測不到Ct值，且無擴增曲線和熔解曲線生成。