[發明專利]經改造的胞嘧啶堿基編輯器及其應用

有效

• 申請號: 202010083072.2
• 申請日: 2020-02-07
• 公開（公告）號: CN113249362B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 楊輝;左二偉
• 申請（專利權）人: 輝大（上海）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C07K19/00;C12N15/55;C12N15/62;C12N15/90
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 羅文鋒;初明明

本發明提供了一種經改造的胞嘧啶堿基編輯器及其應用。本發明人改造了胞嘧啶堿基編輯器，該胞嘧啶堿基編輯器的靶向編輯效率、保真度得以顯著性提高。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體地，本發明涉及一種經改造的胞嘧啶堿基編輯器及其應用。

背景技術

堿基編輯已被廣泛應用于進行有針對性的堿基編輯，在糾正致病突變方面具有很大的潛力。

CRISPR/Cas和base?editors介導的基因編輯方法已經開發出來，并為治療致病性突變引起的遺傳疾病帶來了很大的希望。基于CRISPR/Cas基因編輯或者堿基編輯的臨床應用需要綜合性分析脫靶效應，減少有害突變的風險。盡管本領域中開發了多種方法來檢測全基因組的基因編輯細胞的離靶活性，包括高通量全基因組易位測序(HTGTS)，全基因組，雙鏈斷裂的無偏差識別(GUIDE-seq)和通過循環測序在體外報告切割效率(CIRCLE-seq)。然而，這些方法都不能有效地檢測單核苷酸變異(SNV)。至今本領域還沒有一種有效的方法來檢測SNV。

并且，CRISPR/Cas在應用時，缺陷在于同源介導修復的低編輯效率。本領域人員利用16個堿基長的XTEN接頭(XTEN?linker)將胞苷脫氨酶APOBEC1與dCas9連接在一起，從而構建出第一代堿基編輯器(BE1)。為了增加體內編輯效率，第二代堿基編輯器(BE2)系統除了將胞苷脫氨酶與dCas9連接在一起之外，還將堿基切除修復抑制劑UGI與dCas9融合在一起，從而將編輯效率提高三倍，最高達到20％左右。

為了將堿基編輯效率提高，本領域人員將dCas9換為Cas9n來模擬錯配修復，從而構建出第三代堿基編輯器(BE3)。BE3在非互補DNA鏈上產生切口，細胞使用含尿嘧啶(U)的DNA鏈作為模板來進行修復，從而復制這種堿基編輯。在人細胞系的多種靶基因中，這種BE3系統使得堿基編輯效率發生顯著性地提高，它的平均indel(insertion-deletion)發生率僅為1.1％。對這些測試的靶基因而言，這些數字是對Cas9介導的HDR的巨大改進；平均的HDR介導的編輯頻率僅為0.5％，并且相比于之前的單堿基編輯，更多的indel被觀察到。在多次細胞分裂中，CRISPR堿基編輯持續存在，說明這種方法產生穩定的堿基編輯。但是，這種BE3系統也會遭受脫靶編輯的影響。

然而，先前的研究已經證明胞嘧啶堿基編輯器(CBE)具有DNA和RNA脫靶效應。減少不必要的DNA和RNA脫靶效應對于科學研究以及治療應用有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種經改造的胞嘧啶堿基編輯器及其應用。

在本發明的第一方面，提供一種提高胞嘧啶堿基編輯器靶向編輯效率或保真度的方法，包括：在胞嘧啶堿基編輯器中，對其中的胞嘧啶脫氨酶進行改造，所述的胞嘧啶脫氨酶包括APOBEC1或其同源物，所述的改造包括對該胞嘧啶脫氨酶的相應于APOBEC1第90位Trp(W)和第126位Arg(R)的氨基酸進行突變，且將該胞嘧啶堿基編輯器與核定位序列連接。

在一個優選例中，所述的胞嘧啶堿基編輯器為BE3基因編輯器系統。

在另一優選例中，所述APOBEC1同源物包括選自下組的酶：AID，APOBEC3G，APOBECA3A，CDA1。

在另一優選例中，所述的突變為對所述胞嘧啶脫氨酶的相應于APOBEC1第90位Trp突變為Tyr(Y)；和/或，將第126位Arg突變為Glu(E)。

在另一優選例中，該胞嘧啶堿基編輯器的N端和/或C端連接核定位序列。較佳地在胞嘧啶堿基編輯器中UGI的C端或在胞嘧啶脫氨酶的N端。

在本發明的另一方面，提供一種經改造的胞嘧啶脫氨酶，所述胞嘧啶脫氨酶包括APOBEC1或其同源物，該胞嘧啶脫氨酶中相應于APOBEC1第90位Trp(W)和第126位Arg(R)的氨基酸存在突變。