[發(fā)明專利]活體采集牛卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精和胚胎培養(yǎng)的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010082016.7
• 申請日: 2020-02-06
• 公開（公告）號: CN111269876A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王娜;王小武;趙明禮;郝少強(qiáng);郭晶;張月橋;郭春明
• 申請（專利權(quán)）人: 天津博裕力牧科技有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;A61D19/04;A01N1/02
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1.牛體外受精胚胎培養(yǎng)的方法，其包括如下步驟：

(1)卵母細(xì)胞的采集和體外成熟

a)活體采集：取?；铙w采卵來源的卵泡液，在體視顯微鏡下?lián)斐鲋辽俸?層卵丘細(xì)胞包裹的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，放入包含HEPES的運(yùn)輸培養(yǎng)液中38.8℃、無二氧化碳供應(yīng)、24h內(nèi)運(yùn)回實驗室；

b)將以上離體采集或者活體采集所得COCs在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中洗滌1次，再轉(zhuǎn)移到新的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)22-24h，培養(yǎng)條件為38.8℃、5.5-6.5％CO2、飽和濕度；

(2)體外受精

將成熟的COCs在受精培養(yǎng)液中洗滌1次，再轉(zhuǎn)移到受精培養(yǎng)液中，放入培養(yǎng)箱中，備用；

從液氮中取一支凍精細(xì)管，37℃水浴解凍；無菌操作剪開細(xì)管兩端，使精液注入盛有精液制備培養(yǎng)液的15mL離心管中，328×g離心2次，每次5min，離心后棄上清；將300μL精液制備培養(yǎng)液加入上述離心管，重懸精子沉淀，取適當(dāng)?shù)木討乙哼M(jìn)行精子計數(shù)；

將計算好體積的精子懸液加入盛有卵母細(xì)胞的受精培養(yǎng)液滴中，并將培養(yǎng)盤放入培養(yǎng)箱，使精卵共孵育16-20h，培養(yǎng)條件為38.8℃、5.5-6.5％CO2、飽和濕度；

(3)胚胎體外培養(yǎng)及保存

體外受精操作完畢后，將胚胎周圍的顆粒細(xì)胞用剝卵針去除干凈，放入胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)，此時記為胚胎培養(yǎng)的第1天，培養(yǎng)條件為38.8℃、6％O2、88％N2、飽和濕度，第3天記錄卵裂率；第7天記錄囊胚率，至第9天時統(tǒng)計囊胚孵化率(其為孵化囊胚數(shù)除以囊胚數(shù)所得百分?jǐn)?shù))，并進(jìn)行質(zhì)量鑒定；

將可用胚胎在保存液中洗滌3次，在平衡液中平衡10min后轉(zhuǎn)移入冷凍液，按5段裝液法裝入胚胎，做好標(biāo)記，再放入程序降溫儀中按照0.5℃/min的速度降至-35℃后，將胚胎細(xì)管迅速取出，置入液氮中冷凍保存。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(1)之(b)中，所述成熟培養(yǎng)液是添加了100mL/LFBS、10μg/mL FSH、10μg/mL LH、1μg/mL E2、20ng/mL EGF的BY基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(1)之(a)中，所述運(yùn)輸培養(yǎng)液中包含：甘氨酸50.0mg/L、L-丙氨酸25.0mg/L、L-精氨酸鹽酸鹽70.0mg/L、L-天冬氨酸30.0mg/L、L-胱氨酸二鹽酸鹽26.0mg/L、L-谷氨酸75.0mg/L、L-谷氨酰胺100.0mg/L、L-組氨酸鹽酸鹽一水合物21.88mg/L、L-羥基脯氨酸10.0mg/L、L-異亮氨酸40.0mg/L、L-亮氨酸60.0mg/L、L-賴氨酸鹽酸鹽70.0mg/L、L-甲硫氨酸15.0mg/L、L-苯丙氨酸25.0mg/L、L-脯氨酸40.0mg/L、L-絲氨酸25.0mg/L、L-蘇氨酸30.0mg/L、L-色氨酸10.0mg/L、L-酪氨酸二鈉鹽二水合物58.0mg/L、L-纈氨酸25.0mg/L、抗壞血酸0.05mg/L、生物素0.01mg/L、氯化膽堿0.5mg/L、D-泛酸鈣0.01mg/L、葉酸0.01mg/L、甲萘醌0.01mg/L、煙酰胺0.025mg/L、煙酸0.025mg/L、對氨基苯甲酸0.05mg/L、鹽酸吡哆醛0.025mg/L、鹽酸吡哆醇0.025mg/L、核黃素0.01mg/L、鹽酸硫胺素0.01mg/L、維生素A醋酸酯0.1mg/L、維生素D2即骨化醇0.1mg/L、α-生育酚磷酸鈉鹽0.01mg/L、肌醇0.05mg/L、無水氯化鈣200.0mg/L、硝酸鐵九水合物0.7mg/L、無水硫酸鎂97.67mg/L、氯化鉀400.0mg/L、氯化鈉6800.0mg/L、磷酸二氫鈉一水合物140.0mg/L、硫酸腺嘌呤10.0mg/L、5'-磷酸腺苷0.2mg/L、三磷酸腺苷1.0mg/L、膽固醇0.2mg/L、葡萄糖1000.0mg/L、脫氧核糖0.5mg/L、還原型谷胱甘肽0.05mg/L、鹽酸鳥嘌呤0.3mg/L、次黃嘌呤鈉0.354mg/L、酚紅20.0mg/L、核糖0.5mg/L、醋酸鈉50.0mg/L、胸腺嘧啶0.3mg/L、吐溫80為20.0mg/L、尿嘧啶0.3mg/L、黃嘌呤鈉0.3mg/L，以及0.01IU/mL的FSH、0.01IU/mL的LH、1μg/mL的E₂，50ng/mL的EGF、100ng/mL的IGF、10％慶大霉素、55μg/mL丙酮酸鈉、1.2mM/L半胱氨酸、3mg/mL的BSA、10mM/L的HEPES。