[發(fā)明專利]一種快速檢測豬瘟病毒（CSFV）的RDA方法及試劑盒

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010081201.4
• 申請日: 2020-02-06
• 公開（公告）號: CN112301158A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉華勇;文荻琛;陳翀
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州普世君安生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
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本發(fā)明公開一種快速檢測豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）的RDA方法及試劑盒，包括特異性引物對以及RDA熒光標記探針，以實現(xiàn)對豬瘟病毒（CSFV）的安全、特異、靈敏、簡便的檢測，從而彌補現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測技術(shù)的不足。本發(fā)明中提供的試劑盒可省去核酸提取步驟，在恒溫條件下20min內(nèi)實現(xiàn)豬瘟病毒（CSFV）的檢測，特異性為100％，與普通PCR方法相比，RDA熒光法在恒溫下反應(yīng)，不需變溫，不需復(fù)雜儀器，而且反應(yīng)時間短，適用于現(xiàn)場快速檢測。本發(fā)明的方法及其試劑盒具有操作簡單、快速、特異性好、靈敏度高、成本低廉等特點，可為豬瘟病毒（CSFV）現(xiàn)場快速檢測篩查提供有效的技術(shù)手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種基于RDA熒光法檢測技術(shù)檢測豬瘟病毒（CSFV）的引物對、探針及相關(guān)試劑盒。

背景技術(shù)

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fevervirus，CSFV）引起豬的以稽留高熱、皮膚和黏膜出現(xiàn)大量出血點為主要特征的一種高度接觸性、致死性的傳染病，主要通過呼吸道和消化道傳染，傳播速度快，發(fā)病率和病死率高，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，被世界動物衛(wèi)生組織列為必須報告的動物傳染病，被我國農(nóng)業(yè)部列為一類動物疫病，是危害我國養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的動物疫病之一。為有效預(yù)防和控制該病，急需加強CSFV檢測技術(shù)的研究工作。目前，豬瘟的檢測主要包括病毒的分離與鑒定、血清學及分子生物學檢測方法。病毒分離鑒定操作繁瑣，周期長，不適于大批量樣品檢測；血清學方法不能用于CSFV感染的早期診斷；PCR易引起交叉污染，且不能定量。

實時熒光定量PCR是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，它融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點，直接探測PCR過程中熒光信號的變化以獲得定量的結(jié)果。因其具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，在分子診斷、分子生物學研究、動植物檢疫以及食品安全檢測等方面得到了廣泛應(yīng)用。PCR檢測時需要依賴PCR儀或昂貴的實時定量PCR儀，及其它多種配套設(shè)備，需配備專門的PCR實驗室和專業(yè)操作人員，其成本和應(yīng)用范圍均受到一定限制。隨著體外核酸恒溫擴增的悄然興起，傳統(tǒng)擴增技術(shù)的局限性有所改變，在過去的十年中，使核酸體外擴增變得更加簡單和方便的一些等溫核酸擴增技術(shù)已得到快速發(fā)展，如LAMP（環(huán)介導(dǎo)核酸擴增技術(shù)）、HDA（解旋酶依賴等溫核酸擴增技術(shù)）等均可在等溫條件下擴增核酸分子。這些技術(shù)只需要溫度控制裝置來保持一個恒定反應(yīng)溫度，就可以實現(xiàn)高效的核酸擴增，從而得以擺脫對精密控制溫度變化的PCR儀的依賴。若能在更低的溫度條件下，甚至在常溫條件下實現(xiàn)核酸的擴增，將進一步使核酸擴增技術(shù)簡單化，并有利于此類技術(shù)更廣范圍的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有豬瘟病毒檢測技術(shù)的缺陷和不足。研究得到一種豬瘟病毒（CSFV）RDA熒光法檢測試劑盒，實現(xiàn)豬瘟病毒（CSFV）的快速檢測，在檢測CSFV的整個過程中，從樣本處理到結(jié)果完成，僅需20-30min，大大縮短了常規(guī)的檢測時間，提高檢測效率。該技術(shù)可結(jié)合便攜式的樣本處理技術(shù)，不依賴于實驗室設(shè)備，可采樣現(xiàn)場進行檢測，對豬瘟病毒感染等疾病控制具有重要意義。

本發(fā)明目的在于，提供優(yōu)選后的檢測豬瘟病毒的探針及引物對。

所述探針核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .2所示。

優(yōu)選地，采用兩種方案設(shè)計RDA熒光標記探針，第一種方案為：在靶標區(qū)域選擇25-35bp保守序列為探針序列，5’端標記發(fā)光基團，3’端標記淬滅基團，第5-10位堿基中任一位置用四氫呋喃殘基（THF）替代。第二種方案為：探針長度為 46-52 個核甘酸，其中至少 30個位于 THF 位點的 5’端，另外至少 15 個位于其 3’端。通過系列實驗比對，兩種探針設(shè)計方案均適用于RDA熒光檢測方法，在檢測的靈敏度和特異性上無明顯差異。