[發(fā)明專利]一種快速檢測犬冠狀病毒（CCV）的RDA方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010081190.X
• 申請日: 2020-02-06
• 公開（公告）號: CN112301153B
• 公開（公告）日: 2023-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 季宇;文荻琛;劉華勇;陳翀
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州普世君安生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
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1.一種檢測犬冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括核酸提取試劑、恒溫擴增反應(yīng)模塊、陽性對照和陰性對照，以及探針及引物對，所述探針核苷酸序列如SEQ?IDNO.1或SEQ?ID?NO.2所示，引物對核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示，所述靶標(biāo)序列如SEQ?ID?NO.5所示，所述的恒溫擴增反應(yīng)模塊為RDA或RPA恒溫擴增反應(yīng)混合試劑的凍干粉試劑；所述RDA恒溫擴增反應(yīng)混合試劑的凍干粉試劑包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示的重組酶KX和核苷酸序列如SEQ?ID?NO.8所示的輔助蛋白KY。

2.如權(quán)利要求1所述的檢測犬冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，所述的探針為5’-FAM-TCACT[THF]AGTGCTATTACCAACAGCTTATGA-BHQ1-3′或者

5’-CCAAACGGCATGGTTTTCTTTCACTCAGTGC[FAM-dT]A[THF][BHQ1-dT]ACCAACAGCTTATGA[C3-spacer]-3。

3.如權(quán)利要求1所述的檢測犬冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，所述的RDA恒溫擴增反應(yīng)混合試劑的凍干粉試劑為重組酶KX60-600ng/μL、KY蛋白16-192ng/μL、單鏈結(jié)合蛋白gp32100-1000ng/μL、鏈置換DNA聚合酶3-100ng/μL、反轉(zhuǎn)錄酶200U、核酸外切酶30～200U、肌酸激酶0.1-0.8mg/ml、磷酸肌酸25-75mM、Tris緩沖液20～100mM、聚乙二醇2.5％-10％、醋酸鉀或醋酸鈉0-150mM、dATP1-5mM、dNTPs150-600nM、二硫蘇糖醇1-12mM、權(quán)利要求1所述的探針150nM-600nM、權(quán)利要求1所述的引物對150-600nM。

4.如權(quán)利要求1所述的檢測犬冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，所述的核酸提取試劑為BufferA和BufferB；所述BufferA為樣本裂解液，組成為Tris-HCL緩沖體系、NaOH、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸、異硫氰酸胍、Tween80和曲拉通；所述BufferB為Tris緩沖體系、氯化鉀和氯化鎂；所述陽性對照為含有犬冠狀病毒靶標(biāo)基因的質(zhì)粒，所述陰性對照為空載體pUC57質(zhì)粒。

5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒在制備檢測犬冠狀病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用包含以下步驟：

提取待測樣品的核酸，以待測樣品的核酸為模板，在犬冠狀病毒的引物對、探針及RDA恒溫擴增反應(yīng)混合試劑的凍干粉試劑、BufferA和BufferB存在下進行實時熒光RDA反應(yīng)，根據(jù)實時熒光RDA擴增曲線分析待測樣品；其中所述探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1或SEQID?NO.2所示；其中反應(yīng)溫度為25-42℃，反應(yīng)時間大于10分鐘。

6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒在制備檢測犬冠狀病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述反應(yīng)溫度為39℃，所述反應(yīng)時間為30分鐘。