[發明專利]氯嘧磺隆降解酶Kj-GST、其編碼基因Kj-gst及應用

有效

• 申請號: 202010077549.6
• 申請日: 2020-01-30
• 公開（公告）號: CN111269896B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 張浩;張思勝;張程;張祥輝;劉金亮;潘洪玉
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;A62D3/02;A62D101/04;A62D101/28;A62D101/26
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 劉世純;王恩遠

一種氯嘧磺隆降解酶Kj?GST、其編碼基因Kj?gst及應用，屬于微生物基因工程技術領域。我們成功從Klebsiella jilinsis 2N3中克隆出基因KJ?gst，在GenBank比對結果表明該基因為一個谷胱甘肽S轉移酶基因，全長(從起始密碼子到終止密碼子)為669bp，編碼222個氨基酸。本發明所述的氯嘧磺隆降解酶Kj?GST能夠高效降解氯嘧磺隆，質樸分析顯示其可以將氯嘧磺隆水解產生鄰磺酸苯甲酸亞胺和2?氨基?6?甲氧基嘧啶。基因KJ?gst可用于構建降解氯嘧磺隆的轉基因微生物或植物，亦可用于生產降解氯嘧磺隆的酶制劑，用于消除土壤、水體和農產品中的氯嘧磺隆殘留。

技術領域

本發明屬于微生物基因工程技術領域，具體涉及一種氯嘧磺隆降解酶Kj-GST、其編碼基因Kj-gst及應用。

背景技術

磺酰脲類除草劑是世界范圍內控制主要農作物雜草的一類重要除草劑。磺酰脲類除草劑通過抑制植物體內乙氧基酸合酶(AHAS)的合成來控制農田雜草的生長。AHAS是細菌、真菌和植物中纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑中的關鍵酶。磺酰脲類除草劑具有高效、低用量、多品種選擇性等特點，近年來發展迅速。氯嘧磺隆化學名稱為2-(4-氯-6-甲氧基嘧啶-2-基氨基甲酰氨基磺酰基)苯甲酸乙酯，屬于磺酰脲類除草劑的一種，為無色晶體，熔點181℃，密度1.51g/cm³(25℃)，略溶于有機溶劑。在中性至堿性土壤中，氯嘧磺隆的降解速度非常緩慢，殘留時間可持續數月至一年以上。土壤中的氯嘧磺隆殘留嚴重危害豆科、油菜等磺脲類敏感作物的后續輪作，造成嚴重的農業損失。利用微生物降解殘留的氯嘧磺隆是一條可行的道路。微生物對氯嘧磺隆的降解主要有兩個途徑：(1)微生物分泌降解酶，降解酶通過水解、氧化等作用使磺酰脲類除草劑的脲橋發生斷裂；(2)對于一些有酯結構的磺酰脲類除草劑(如氯嘧磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆等)，酯鍵被微生物產生的相應酯酶水解。目前已經有一些關于菌株降解氯嘧磺隆的報導，但大多效果不顯著。要利用微生物降解技術解決氯嘧磺隆殘留問題首要要求就是找到優良的微生物資源。

吉林克雷伯氏菌2N3(Klebsiellajilinsis 2N3，簡稱2N3)是由吉林農業大學張浩教授2009年分離自農藥廠廢水處理池污泥的一株氯嘧磺隆降解菌(專利號ZL 2009 10218087.9)，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 209248。質譜分析結果表明，2N3可以將氯嘧磺隆脲橋水解產生鄰磺酸苯甲酸亞胺和2-氨基-6-甲氧基嘧啶。在基礎無機鹽培養基中，2N3以氯嘧磺隆作為單氮源進行生長，在使用氯嘧磺隆進行誘導培養后，可以高效地降解氯嘧磺隆。在30℃～35℃、pH值為6～7的基礎無機鹽培養基中，12h內可將初始濃度20mg/L和100mg/L的氯嘧磺隆分別降解83.5％和92.5％。

發明內容

本發明目的在于提供一種氯嘧磺隆降解酶Kj-GST、其編碼基因Kj-gst以及二者的應用。基因Kj-gst可以用于構建降解氯嘧磺隆的菌液，并且可以用于生產降解氯嘧磺隆的酶制劑用來消除不同環境里的氯嘧磺隆殘留。

本發明所述的氯嘧磺隆降解基因Kj-gst來自于2N3。實驗證實在缺少基因Kj-gst后，2N3降解氯嘧磺隆的能力大大下降，并且2N3的降解能力在基因Kj-gst回補之后得到了回復。本發明成功在2N3中克隆出氯嘧磺隆降解基因Kj-gst，其在GenBank比對結果表明該基因為谷胱甘肽S轉移酶基因。

本發明所述的氯嘧磺隆降解基因Kj-gst，其DNA序列如SEQ ID No:1所示。該DNA序列為Kj-gst的開放閱讀框，長度為669bp，編碼222個氨基酸。本發明所述的氯嘧磺隆降解酶Kj-GST，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

本發明所述的氯嘧磺隆降解酶Kj-GST可以高效地降解氯嘧磺隆，在敲除基因Kj-gst后，2N3對氯嘧磺隆的降解能力有了明顯的下降；在將敲除基因回補后，2N3降解氯嘧磺隆的能力有了恢復。基因KJ-gst可用于構建降解氯嘧磺隆的轉基因微生物或植物，亦可用于生產降解氯嘧磺隆的酶制劑，用于消除土壤、水體和農產品中的氯嘧磺隆殘留。