[發明專利]一種雙鏈DNA肽連接酶dDPlaseI及其使用方法

有效

• 申請號: 202010077330.6
• 申請日: 2020-01-27
• 公開（公告）號: CN111088235B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發明（設計）人: 黃志玲;黃種山;其他發明人請求不公開姓名
• 申請（專利權）人: 黃種山
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12P21/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種新型的可用于催化特定雙鏈DNA和特定多肽共價連接的雙鏈DNA肽連接酶dDPlaseI及其酶學特性和使用方法。dDPlaseI酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，對應的基因編碼序列如SEQ ID NO：5所示；dDPlaseI酶可以識別5’末端起始為5’?ATGATCCAG?3’雙鏈序列且該5’末端脫氧核糖核苷酸A為磷酸化狀態的特定DNA雙鏈和C末端起始為N’?MANCEHL?C’這7肽的特定多肽鏈，并催化這兩者以共價鍵相互連接在一起；雙鏈DNA和多肽連接產物在360nm波長處有特征吸收峰，可用于dDPlaseI連接酶反應活性的測定。dDPlaseI連接酶緩沖液是由pH為7.8的450mM Tris?Hcl、100mM Mg²⁺、80mM NaCl、20mM ATP和8mM Triton X?100組成，其最適反應的溫度范圍是35℃?45℃，連接反應時間為3min?10min。本發明提供的全新的雙鏈DNA多肽連接酶，可以作為基因工程和基因分析的工具酶。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種全新的可以連接特定雙鏈DNA片段和特定多肽的連接酶及其使用方法。

背景技術

基因工程領域離不開各種分子生物學工具酶，這些工具酶可以實現體外的核酸擴增、轉錄或反轉錄、消化或切除、連接和修飾以及蛋白的消化或切除等，被廣泛用于目的基因擴增、核酸序列分析、重組體DNA制備、載體構建、核酸探針標記和蛋白分析等領域，例如DNA聚合酶是PCR體系中的核心組分，cDNA文庫的構建離不開RNA聚合酶。基因工程常用的工具酶，主要是DNA聚合酶、限制性核酸內切酶、DNA連接酶，此外還有RNA聚合酶、反轉錄酶、核酸外切酶、DNA甲基化酶、核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、多核苷酸激酶、堿性磷酸酯酶、末端核苷酸轉移酶以及各種蛋白酶等。目前商品化的分子工具酶大多數來源于微生物，主要是由于微生物生長增殖速度快、新陳代謝旺盛，此外也便于這些酶的表達和分離純化。自然界中的微生物種類繁多，其所處的微生態各種各樣，因此其新陳代謝形式和過程多種多樣，這些都離不開相應的能執行各種生化反應的酶，因此微生物是分子酶的巨大資源庫。例如來源于T4噬菌體的T4連接酶，該酶原本就是噬菌體用于修復被宿主細胞的限制性核酸內切酶切斷的DNA的，其連接效率十分高效。隨著越來越多的酶分子被挖掘，分子工具酶的數量和用途不斷增加，這大大開拓了基因工程的研究和應用領域。

申請人前期在研究干枯稻草降解的微生物生態體系時，發現體系中存在著一種特定的單鏈RNA肽連接酶，可以識別特定mRNA的5’端特定序列并將其和特定多肽進行共價連接，從而調控特定mRNA翻譯為蛋白這一過程。進一步的借助生物信息分析設計，申請人對該單鏈RNA肽連接酶基因進行改造，開發出了1種特定的單鏈DNA肽連接酶和2種特定的雙鏈DNA肽連接酶，分別可以識別特定單鏈DNA的5’末端上特定DNA單鏈序列或特定雙鏈DNA的5’末端上特定DNA雙鏈序列并將其和特定多肽進行共價連接。在對這些核酸肽連接酶外源表達的基礎上，申請人探究了其酶學特性和使用方法。目前已有多種商業化的DNA連接酶（如美國賽默飛公司的T4 DNAlagase）和修飾酶（NEB公司的DNA甲基化酶），僅是對核酸片段進行相互連接和特定修飾，尚未見報道可以實現核酸片段和多肽片段相互共價連接的連接酶。本發明提供了全新的核酸多肽連接酶，可以作為基因工程和基因分析的工具酶，在核酸標記和核酸分析等領域中具有巨大的應用前景。

發明內容

本發明提供了新的可用于連接特定核酸片段和特定多肽片段的核酸多肽連接酶及其酶學特性和使用方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案如下：