[發明專利]一種適用于臍血來源NK細胞的高效擴增工藝

在審

• 申請號: 202010075926.2
• 申請日: 2020-01-23
• 公開（公告）號: CN111073854A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 張揚;李陶;高力揚;張立忠;周曉宇
• 申請（專利權）人: 中科寶承生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種適用于臍血來源NK細胞的高效擴增工藝，其特征在于，所述的操作工藝包括以下步驟：

一、超凈臺/生物安全柜提前開紫外消毒30min,并提前開空調機組30min；

二、工作人員消毒滅菌后入潔凈區；

三、采70ml臍血，將其放至標本傳遞窗，檢查是否有母體完整的病毒檢測體檢報告，若沒有病毒體檢報告，則要需要送臍血血漿到質檢中心作以上的病毒檢測，核對血袋上相應的信息和采集表上信息是否一致，并觀察包裝情況、血樣有沒有異常情況，經核對合格后可進行下一步操作；

四、用5ml移液管吸取18mlD-PBS加入T175培養瓶中，再加入相應試劑盒因子，用移液管吸取T175培養瓶中的D-PBS洗試劑盒2-3次，用封口膜封口，37℃培養箱內包被2h；

五、用2支50ml離心管離心全血，800g×15min離心，用10ml移液管收集臍血血漿，其余血漿56℃水浴滅活30min，放置-20℃10min后再次離心處理，1100g×15min離心，取上清血漿做好標記待用；

六、取步驟五中離心后下部細胞部分，加入D-PBS至50ml打勻；

七、準備兩支50ml的高效離心管，各加入12.5ml人淋巴細胞分離液，200g×2min離心，使分離液完全處于隔膜下方且沒有氣泡，將打勻的細胞緩慢均勻的加入到2個50ml離心管中，800g×15min離心；

八、取分離后的白膜細胞層（新手離心后隔板上的細胞都是所需細胞,待熟練后可舍棄部分細胞），加入到50ml離心管中，加入未加因子的培養基至50ml，吹打均勻，600g×10min離心；

九、步驟八中上部分離出的PBMC用未加任何因子的NK-EX培養基混勻成細胞懸液40ml，細胞懸液中加入相應試劑盒因子，取出包被好的T175瓶，用吸管吸出其中的包被液體，吸的過程中不要碰包被面，加入10ml血漿，加入40ml細胞懸液，用酒精棉球擦拭瓶口和封口膜并用封口膜封口，置于37℃，5%二氧化碳飽和濕度培養箱內培養；

十、NK培養液配制方法：增殖培養基為每瓶1000ml NK-EX培養基加入相應試劑盒因子；活化培養基為每500ml增殖培養基中加入本試劑盒一支相應試劑盒因子；先使用活化培養基，再使用增殖培養基；

十一、第4天：加入40ml活化培養基，加入10ml血漿，加入相應試劑盒因子；

十二、第6天：加入70ml NK活化培養基，加入10ml血漿，加入相應試劑盒因子；

十三、第8天轉袋：NK細胞在T175培養瓶中培養一段時間，細胞數達到一定數量便要將細胞轉入到一個培養袋中繼續進行培養；

（1）從培養箱中拿出培養NK細胞的T175瓶標記為，顯微鏡下觀察細胞狀態和數量，觀察過之后將其放在超凈工作臺內操作，用酒精棉球擦拭瓶口，并將其中的培養液倒入備好的T175培養瓶中標記為，將剩余血漿全部倒入該培養瓶內，用移液管吸10ml 活化培養基于培養瓶內，并不斷吹洗瓶的內壁10-20次，如此反復3次，直到把瓶內壁上的大部分細胞吹掉，并把培養液加入到培養瓶中；

（2）準備一個50ml注射器，檢查是否漏氣，去除針頭和推進器，用鑷子夾著注射器放在補液架上；

（3）拿一個血培養袋平鋪在超凈臺內，用酒精棉球擦拭培養袋的進樣口管，用鑷子打開蓋子，將進樣管連在50ml注射器上，打開止液夾，加入約100ml活化培養基檢測袋子是否漏液；

（4）檢測完畢，加入瓶中的細胞懸液，在該培養瓶內加入新鮮培養液洗一下瓶子，洗液倒入培養袋內，清洗兩次；

（5）細胞懸液倒入細胞袋內之后開始加入新鮮的培養基，加入剩下的所有活化培養基；

（6）加入培養基完成之后，排干凈進樣管內的液體，關閉止液夾，蓋上進樣管的蓋子，用酒精棉球擦拭蓋子周圍和封口膜，并用封口膜封該培養袋進液管口，放到37度5%二氧化碳飽和濕度培養箱中培養；

十四、第10天：觀察細胞生長狀態以及細胞的數量，數量達到一定程度，且培養基明顯變黃，需要補液500ml，此時加入的是增殖培養基；

（1）將培養袋平鋪于超凈工作臺上，50ml注射器檢漏并留管體，置于補液架上；

（2）用鑷子撕掉培養袋進液口封口膜，用酒精棉球消毒并打開進液口蓋子；

（3）將進液口與注射器進口連接；

（4）將活化培養基倒入注射器管中，打開進液管上的止液夾，倒入500ml培養液；

（5）拔掉進液管，排凈管內液體，關閉止液夾，用鑷子蓋上蓋子，酒精棉擦拭消毒，封口膜封口；

十五、第13天：視細胞生長狀態，每個培養袋補加NK增殖1000ml，混勻，取出30ml培養液，送檢第三方做檢測同時做好自檢；

十六、第16天：收集NK細胞懸液，計數凍存。