[發(fā)明專利]一種利用古菌分子標(biāo)記OTU240快速檢測城市綠地土壤全鉀含量的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010074818.3
• 申請日: 2020-01-22
• 公開（公告）號: CN113151410B
• 公開（公告）日: 2022-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張浪;韓繼剛;張維維;張琪;王香春
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 何葉喧

本發(fā)明公開了一種利用古菌分子標(biāo)記OTU240快速檢測城市綠地土壤全鉀含量的方法。本發(fā)明提供了一種DNA分子(探針)，如序列表的序列1所示。本發(fā)明還保護所述探針在檢測或輔助檢測土壤全鉀含量中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護所述探針在比較不同地塊的土壤全鉀含量中的應(yīng)用。采用本發(fā)明提供的方法檢測土壤全鉀含量或比較不同地塊的土壤全鉀含量，具有如下優(yōu)點：樣品需求量小，無需前處理，所需時間短，人力成本低，可以實現(xiàn)對大批量樣品的快速自動化檢測。本發(fā)明對于土壤樣品的測評具有重要應(yīng)用推廣價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用古菌分子標(biāo)記OTU240快速檢測城市綠地土壤全鉀含量的方法。

背景技術(shù)

城市園林綠化建設(shè)是生態(tài)文明建設(shè)和美麗中國建設(shè)的重要組成部分，對優(yōu)化城市環(huán)境，提高人民生活質(zhì)量，促進城市可持續(xù)發(fā)展起著重要作用。城市綠地土壤作為城市生態(tài)環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ)，其質(zhì)量直接影響著植物的健康生長以及生態(tài)效益、景觀功能的發(fā)揮，在一定程度上決定著城市綠地質(zhì)量。因此，對城市綠地土壤質(zhì)量進行科學(xué)客觀的監(jiān)測和評價，是城市綠地管理的重要參考和依據(jù)。

目前對城市綠地土壤質(zhì)量指標(biāo)的檢測主要是沿用傳統(tǒng)的理化檢測方法，樣品需求量大，樣品前處理過程復(fù)雜、周期長，尤其所需要的人力資源成本較高，難以實現(xiàn)對大批量樣品的快速檢測。土壤微生物對土壤環(huán)境的變化具有綜合性、敏感性和功能性的特點，探索通過檢測特定微生物類群的豐度來實現(xiàn)對綠地土壤質(zhì)量指標(biāo)的快速和自動化檢測技術(shù)具有重要的現(xiàn)實意義。

鉀是植物生長不可或缺的元素，能夠促進植物光合作用、促進植物碳水化合物及氮素代謝、提高植物抗性。土壤中全鉀的含量是評價土壤肥力質(zhì)量高低的重要指標(biāo)。土壤中的鉀以多種形態(tài)存在，不同形態(tài)的鉀對植物生命活動的有效性不同。目前，土壤中全鉀含量的測定主要采用氫氧化鈉堿熔或高氯酸－氫氟酸消化、火焰光度法及火焰原子吸收法，測定步驟繁瑣，測定周期長。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用古菌分子標(biāo)記OTU240快速檢測城市綠地土壤全鉀含量的方法。

本發(fā)明提供了一種檢測土壤全鉀含量的方法(方法甲)，包括如下步驟：

以土壤樣品的總DNA為模板，進行實時熒光定量PCR；實時熒光定量PCR的擴增引物對由序列表的序列4所示的引物524F-10-ext和序列表的序列5所示的引物Arch958R-mod組成；實時熒光定量PCR的探針的核苷酸序列如序列表的序列1所示；

實時熒光定量PCR獲得Ct值；根據(jù)Ct值計算拷貝數(shù)，通過土壤樣品中的拷貝數(shù)含量計算得到土壤樣品中的全鉀含量。

實時熒光定量PCR的探針為Taqman探針。所述Taqman探針的5’末端具有熒光基團，3’末端具有熒光淬滅基團。所述熒光基團具體可為FAM。所述熒光淬滅基團具體可為TAMRA。

所述拷貝數(shù)為所述探針的靶標(biāo)片段的拷貝數(shù)。

通過土壤樣品中的拷貝數(shù)含量計算得到土壤樣品中的全鉀含量的實現(xiàn)方法為：將土壤樣品的拷貝數(shù)含量代入線性方程，得到土壤樣品的全鉀含量。

線性方程為：y＝0.7057x+13.729；R²＝0.9745；y代表全鉀含量，單位為g/kg；x代表拷貝數(shù)含量，單位為×10⁷拷貝數(shù)/g。

根據(jù)Ct值計算拷貝數(shù)的方法為：將Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到拷貝數(shù)。

所述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的制備方法為：將序列表的序列2所示的DNA分子與pMD18-T載體連接，得到OTU240標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒；采用OTU240標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒制作以拷貝數(shù)的對數(shù)為自變量且以Ct值為因變量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程?？截悢?shù)的對數(shù)為拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)。

土壤樣品的總DNA的制備方法：采用MoBioDNA提取試劑盒(MoBioLaboratories,Carlsbad,Inc.,CA,USA)提取土壤樣品的總DNA。