[發(fā)明專利]基因工程大腸桿菌及制備方法和吲哚-3-乙酸的生產(chǎn)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010073498.X
• 申請日: 2020-01-22
• 公開（公告）號: CN111254105B
• 公開（公告）日: 2023-01-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃建忠;祁峰;吳弘軒;秦麗娜;羅藝獻
• 申請（專利權(quán)）人: 福建師范大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P17/10;C12R1/19
• 代理公司: 北京悅成知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11527
• 代理人: 樊耀峰;高艷麗

本發(fā)明公開了一種基因工程大腸桿菌及制備方法和吲哚?3?乙酸的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的基因工程大腸桿菌包含色氨酸?2?單加氧酶iaaM基因和酰胺酶ami1基因，且所述色氨酸?2?單加氧酶iaaM基因和酰胺酶ami1基因能夠在所述大腸桿菌的胞內(nèi)表達，形成具有活性的色氨酸?2?單加氧酶iaaM和具有活性的酰胺酶ami1。本發(fā)明可以獲得生產(chǎn)吲哚?3?乙酸的基因工程大腸桿菌。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基因工程大腸桿菌及制備方法和吲哚-3-乙酸的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA),化學式C₁₀H₉NO₂，又稱為植物生長素，是植物生長和發(fā)育過程中必不可少的一種植物激素。IAA可以激發(fā)和調(diào)控植物體內(nèi)眾多生化過程，比如通過刺激細胞分裂調(diào)節(jié)植物分生組織以形成橫向不定根等新器官；促進細胞伸長來促進器官的分化和形成；維持植物的向光性、向地性和極性運輸；控制植物代謝和衰老；對病原菌、干旱、重金屬及其螯合物的脅迫緩解和作出應答等。此外，生長素還可以通過與其他激素的相互作用調(diào)節(jié)植物修復等其他生理活動。

植物除了通過自身合成獲得IAA外，還可以通過如植物中的內(nèi)生菌等多種微生物來產(chǎn)生IAA，如假單胞菌(Pseudomonas sp.)、固氮菌(Azotobacter sp.)和固氮螺菌(Azospirillum sp.)等。

目前，國內(nèi)外對IAA生產(chǎn)提取的研究主要集中在植物中提取和微生物合成方面。CN101914053B公開了一種從海藻中制備吲哚乙酸的方法，其通過將海藻浸泡、大孔樹脂吸附、解吸、濃縮、高速逆流色譜純化、結(jié)晶等步驟獲得IAA。CN102888375B公開了一株能促進蘭花組培苗生長及種子萌發(fā)的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌(Mycobacteriumavium)Mya-zh01。該菌株來源于蝴蝶蘭花梗，經(jīng)分離、純化獲得。CN106754516A公開了一株具有分泌IAA能力的內(nèi)生細菌(Lysinibacillus endophyticus)C9^T，為酪氨酸芽孢桿菌屬新種，其通過可培養(yǎng)方法，經(jīng)分離、篩選、基因測序、培養(yǎng)等步驟獲得，該菌株分泌生長素能力為10.2mg/L。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)也逐漸應用在IAA合成中，例如將特定的基因轉(zhuǎn)入到受體細胞中，使得受體細胞具備IAA合成路徑。CN104388369B公開了一種高產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組細胞解淀粉芽孢桿菌菌株SQR9-E和重組枯草芽孢桿菌菌株168-E。通過將吲哚-3-乙酸合成的三種相關(guān)蛋白合成基因重組至受體細胞基因，使得受體IAA合成能力得到提高。還有一種方法是將具備IAA合成路徑的載體導入特定植物中，使得植物的具備IAA生成能力，或植物IAA分泌能力獲得提高，如EP03254645.9公開了一種基因?qū)胫参锏妮d體，該載體包括所需基因和可選標記基因，所述標記基因包括該基因包括編碼生長素前體合成生長素的酶的基因吲哚乙酸水解酶iaaH基因和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶ipt基因，并且不含色氨酸單加氧酶iaaM基因。

植物和特定細菌的IAA生物合成受到復雜的環(huán)境脅迫調(diào)節(jié)，包括pH、滲透脅迫和碳限制等，另外IAA各個合成途徑基因的表達方式以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子也會限制IAA的合成，所以植物或內(nèi)生菌株中自發(fā)合成IAA的量很少。

近年來，生物催化方法取得快速進展，其具有工藝簡單、生產(chǎn)周期短、易于放大等優(yōu)勢，有望成為大規(guī)模生產(chǎn)IAA的理想途徑。但是，現(xiàn)有技術(shù)中缺少相關(guān)途徑的探索和研究，本領(lǐng)域內(nèi)仍然需要生物合成IAA的新方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的在于提供一種基因工程大腸桿菌，其具有產(chǎn)生色氨酸-2-單加氧酶iaaM和酰胺酶ami1的能力。

本發(fā)明的另一個目的在于提供上述基因工程大腸桿菌的制備方法。

本發(fā)明再一個目的在于提供一種吲哚-3-乙酸(IAA)的生產(chǎn)方法，其利用上述基因工程大腸桿菌進行IAA的生物合成。