[發明專利]一種PPK2蛋白及其在用作聚丙烯酰胺凝膠電泳30kd標準品中的應用

在審

• 申請號: 202010072551.4
• 申請日: 2020-01-21
• 公開（公告）號: CN111235129A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 閆東科;宮艷超;許鳳霞;李隴梅;呂平;李冬
• 申請（專利權）人: 天津市職業大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;G01N27/447;G01N30/02
• 代理公司: 天津創智天誠知識產權代理事務所(普通合伙) 12214
• 代理人: 王秀奎

本發明公開了一種PPK2蛋白及其在用作聚丙烯酰胺凝膠電泳30kd標準品中的應用，本發明利用NdeΙ和HindⅢ將ppk2基因插入到原核表達載體pET30a中，重組表達載體通過物理法轉入大腸埃希菌BL21(DE3)菌株中，利用IPTG誘導目的蛋白PPK2在37℃、25℃和16℃下試表達，并通過SDS?PAGE電泳和Western Blotting鑒定分析表達產物；最后，利用3.2L表達菌液進行放大培養，表達產物先后經Ni?IDA親和色譜柱、陽離子交換色譜柱和凝膠過濾色譜柱分離純化。結果顯示：大腸原核表達系統可在16℃、終濃度為0.2mM·L^?1的IPTG誘導下穩定高效表達，PPK2蛋白帶電性質專一，在溶液中以單體形式存在，性質穩定，不易發生降解，半衰期長，具有用作聚丙烯酰胺凝膠電泳30kd標準品的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種PPK2蛋白及其在用作聚丙烯酰胺凝膠電泳30kd標準品中的應用。

背景技術

蛋白標準品的主要作用是用來指示蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳泳道上蛋白條帶所對應的分子量大小，是陽性對照，只有標準品準確無誤，實驗結果才有說服力。除此之外，蛋白標準品還有表示Western Blotting時轉膜成功或者蛋白在凝膠上的電泳程度等作用，所以選擇正確的蛋白標準品是分子生物學實驗取得成功的必要條件之一。

多聚磷酸激酶2(Polyphosphate kinase 2,PPK2)在眾多病原菌的致病性中發揮重要作用，而人等后生動物體內未發現ppk2基因，因而PPK2是新型抗生素開發的靶點。但以PPK2蛋白作為聚丙烯酰胺凝膠電泳的標準品的相關研究未見報道。

發明內容

本發明的主要目的是提出一種PPK2蛋白，所述PPK2蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

本發明還提出一種如上所述的PPK2蛋白的編碼基因。

可選地，所述PPK2蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：

本發明還進一步提出一種包含如上所述PPK2蛋白的編碼基因的表達載體或表達工程菌。

可選地，所述PPK2蛋白表達載體是將上述PPK2蛋白的編碼基因插入到原核細胞表達質粒的NdeΙ和HindⅢ酶切位點之間得到。

可選地，所述原核細胞表達質粒選用pET30a作為親本表達載體。

本發明還提出如上所述的PPK2蛋白在用作聚丙烯酰胺凝膠電泳30kd標準品中的應用。

本發明還提出如上所述的PPK2蛋白的制備方法，如下所述：

重組表達質粒PPK2/pET30a通過物理法轉入大腸埃希菌BL21(DE3)菌株中，利用0.2mM·L^-1終濃度的IPTG誘導3.2L表達菌株(液)中的目的蛋白PPK2在16℃下表達，經系列色譜法純化后濃度可達10mg·mL^-1，純度為95％。

本發明的優點和有益效果為：

1、將PPK2蛋白與Western Blotting電泳標準品14～100kd(100、70、50、40、30、25、14)一同進行SDS-PAGE電泳分析，發現PPK2蛋白條帶清晰，泳道上無其它條帶，且位于30kd處。

2、將PPK2蛋白與常用SDS-PAGE電泳標準品12～80kd(12、20、30、40、60、80)一同進行SDS-PAGE電泳分析，發現PPK2蛋白條帶染色完全，條帶清晰，所在泳道無其它條帶，且正好位于30kd處。