[發(fā)明專利]具有優(yōu)良脅迫耐受性的簡單節(jié)桿菌工程菌株的構(gòu)建方法、菌株及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010069420.0
• 申請日: 2020-01-21
• 公開（公告）號: CN111254143A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發(fā)明（設計）人: 駱健美;王敏;朱文成;崔慧林;賈紅晨;申雁冰
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N1/21;C12N15/74;C12P33/02;C12N15/10;C12R1/06
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

本發(fā)明涉及一種采用啟動子工程、全局轉(zhuǎn)錄機制工程或者二者相結(jié)合的方法獲得的具有優(yōu)良脅迫耐受性的簡單節(jié)桿菌工程菌株。本菌株在高濃度有機溶劑(8％)和底物(15?45g/L)轉(zhuǎn)化體系中仍保持良好活性，其C_1,2脫氫反應產(chǎn)率較對照菌株I(含野生型啟動子和野生型irrE)提高了1.1?2.2倍。這種優(yōu)良脅迫耐受性工程菌株的構(gòu)建及其應用，提高了轉(zhuǎn)化體系中有機溶劑和底物的濃度，進而提高了產(chǎn)物生成量，對于甾體類疏水性化合物高濃度底物轉(zhuǎn)化效率的提高具有重要的指導意義。

技術領域

本發(fā)明屬于代謝工程和微生物轉(zhuǎn)化技術領域，尤其是一種具有優(yōu)良脅迫耐受性的簡單節(jié)桿菌工程菌株的構(gòu)建方法、菌株及其應用。

背景技術

甾體激素類藥物是目前臨床上用量僅次于抗生素的第二大類藥物，具有抗炎癥、抗過敏、抗休克、抗變態(tài)反應等功效，此外，甾體激素還具有改善蛋白代謝、恢復和增強體力、利尿降壓等作用。甾體化合物的C1,2位脫氫反應是工業(yè)上采用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)甾體藥物的典型代表，也是生產(chǎn)氫化潑尼松及其同系物最有價值的一種反應。簡單節(jié)桿菌(Arthrobacter simplex)是目前國內(nèi)工業(yè)上常用的甾體C1,2脫氫反應菌株，具有專一性高、反應速率快等優(yōu)點。如它對醋酸可的松(CA)表現(xiàn)出高活性，生成的產(chǎn)物醋酸潑尼松(PA)的抗炎活性增大了3～4倍。然而，甾體類化合物較差的水溶性(溶解度一般為10^-5-10^-6mol/L)限制了底物與胞內(nèi)生物酶的有效接觸，進而限制了催化反應效率。目前為止，添加有機溶劑是工業(yè)上甾體生物合成工藝中普遍用來改善底物溶解性的方法。但有機溶劑的用量卻因為其對微生物的不利影響受到嚴格控制，這大大限制了轉(zhuǎn)化體系中底物的投料量，最終影響產(chǎn)率。此外，轉(zhuǎn)化體系中高濃度的底物和產(chǎn)物也會對菌株的活力產(chǎn)生抑制作用，進而影響其轉(zhuǎn)化產(chǎn)率。因此，提高菌株的脅迫耐受性，尤其是有機溶劑耐受性，是創(chuàng)建高效菌株的有效策略。

IrrE是來源于耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)R1的一個全局轉(zhuǎn)錄因子。研究者發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)胨拗骶竽軐Π麅?nèi)的整個代謝網(wǎng)絡產(chǎn)生重要的調(diào)控作用，進而改善生物體的各種脅迫耐受性。但大量的研究表明，基因表達水平與復雜目標表型之間存在著非線性的關系。為了獲得理想表型，需要對該基因在宿主生物中的表達水平進行精細調(diào)控。

啟動子是一段能夠被RNA聚合酶特異性識別并結(jié)合從而起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列，它的結(jié)構(gòu)組成顯著影響基因的轉(zhuǎn)錄水平。大多數(shù)原核生物中，啟動子核心區(qū)域主要由-10區(qū)和-35區(qū)組成，這兩個保守區(qū)域是RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合位點，能與σ因子相互識別而具有很高的親和力。因此，啟動子和σ因子之間序列相似性越高，啟動子的強度越高。此外，核糖體結(jié)合位點與起始密碼子之間的距離也是影響基因表達水平的重要因素。目前，研究者主要采取易錯PCR或定點突變技術構(gòu)建啟動子文庫，從中篩選得到能對基因表達水平進行精細調(diào)控的有效表達元件。

全局轉(zhuǎn)錄機制工程是一種全新的改進細胞表型的定向進化方法，通過易錯PCR、DNA shuffling等技術對細胞中的轉(zhuǎn)錄元件進行突變修飾，進而改變RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄效率和對啟動子的親和能力，使細胞的轉(zhuǎn)錄在整體水平上發(fā)生改變。因此，該方法在改善由多個基因控制的復雜表型上具有顯著的優(yōu)勢。

目前尚未發(fā)現(xiàn)采用啟動子工程、全局轉(zhuǎn)錄機制工程或者二者相結(jié)合的方法，對irrE基因的表達水平進行精細調(diào)控及其定向進化去構(gòu)建具有優(yōu)良脅迫耐受性的簡單節(jié)桿菌工程菌株，以及利用該工程菌株進行甾體C_1,2脫氫反應的報道。

通過檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專利申請相關的公開專利文獻。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足之處，提供一種具有優(yōu)良脅迫耐受性的簡單節(jié)桿菌工程菌株的構(gòu)建方法、菌株及其應用，本發(fā)明通過啟動子工程、全局轉(zhuǎn)錄機制工程或者二者相結(jié)合的方法，對全局轉(zhuǎn)錄因子IrrE的表達水平進行精細調(diào)控和定向進化，創(chuàng)建具有優(yōu)良脅迫耐受性的簡單節(jié)桿菌工程菌株，為高效簡單節(jié)桿菌的構(gòu)建提供一種新策略。