[發明專利]一株高效生產蘋果酸的黑曲霉菌株、構建方法及應用

有效

• 申請號: 202010069216.9
• 申請日: 2020-01-21
• 公開（公告）號: CN111218408B
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 劉浩;徐永學;徐晴;黃和;曹威
• 申請（專利權）人: 天津科技大學;南京師范大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;C12N15/66;C12N15/65;C12P7/46;C12R1/685
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

本發明涉及一株高效生產蘋果酸的黑曲霉基因工程菌株，所述黑曲霉基因工程菌株是敲除了檸檬酸轉運蛋白基因cexA，并過表達了黑曲霉來源的葡萄糖轉運蛋白基因mstC、己糖激酶基因hxkA、磷酸果糖激酶基因pfkA和丙酮酸激酶基因pkiA的黑曲霉基因工程菌株。本發明黑曲霉基因工程菌株生產蘋果酸的效率顯著提高，經發酵罐分批補料發酵第八天的產量達到195.72～210g/L，蘋果酸對葡萄糖的轉化率達到1.59～1.64mol/mol，發酵周期較出發菌株縮短一天，由原來的9天縮短至8天。為微生物發酵法制備蘋果酸提供了優良菌種。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，尤其是一株高效生產蘋果酸的黑曲霉菌株、構建方法及應用。

背景技術

黑曲霉作為重要的細胞工廠用于有機酸的發酵生產已有100多年的歷史，不僅是GRAS(generally regarded safe)菌株，而且能夠利用廉價的碳源。L-蘋果酸，又名2-羥基丁二酸，主要用于食品、醫藥等行業。在食品行業，L-蘋果酸主要用作食品酸味劑，與檸檬酸相比，具有味道柔和、酸度大，滯留時間長等特點，且不損害口腔牙齒、不積累脂肪，成為一種低熱量的國際食品界公認的安全性食品酸味劑，是目前世界食品行業中用量最大和發展前景較好的有機酸之一。在醫藥行業，L-蘋果酸被用于治療肝病、貧血、尿毒癥等多種疾病。而且由于L-蘋果酸在代謝上利于氨基酸的吸收，常被配入復合氨基酸注射液中。由于L-蘋果酸酸味刺激效果優于檸檬酸，而且因西方發達國家消費者對化學合成產品持謹慎和懷疑態度，因此發酵生產的天然產品L-蘋果酸在食品和醫藥領域應用范圍在擴大，并且美國FDA禁止在食品中使用DL-蘋果酸，又限制了檸檬酸在兒童、老年食品中的應用，所以近幾年來L-蘋果酸在食品工業的應用已逐漸取代檸檬酸，因此，國際市場上對L-蘋果酸的需求量與日俱增。

當前，應用黑曲霉發酵生產蘋果酸存在生產效率低，發酵生產周期長且副產物檸檬酸積累較高等問題，造成生產成本過高且后續復雜的蘋果酸分離純化工藝，因此，構建一種高效生產蘋果酸的黑曲霉菌株，以提高蘋果酸的生產效率、縮短發酵周期并消除副產物十分必要。

通過檢索，尚未發現與本發明專利申請相關的公開專利文獻。

發明內容

本發明目的在于克服現有技術中的不足之處，提供一株高效生產蘋果酸的黑曲霉菌株、構建方法及應用。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一株高效生產蘋果酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株，所述黑曲霉基因工程菌株是敲除了檸檬酸轉運蛋白基因cexA，并過表達了黑曲霉來源的葡萄糖轉運蛋白基因mstC、己糖激酶基因hxkA、磷酸果糖激酶基因pfkA和丙酮酸激酶基因pkiA的黑曲霉基因工程菌株。

而且，所述基因cexA序列在NCBI-Gene ID是4989494，所述基因mstC序列在NCBI-Gene ID是4978840，所述hxkA基因在NCBI-Gene ID是4979978，所述基因pfkA序列在NCBI-Gene ID是4989727，所述基因pkiA序列在NCBI-Gene ID是4982167。

如上所述的高效生產蘋果酸的黑曲霉基因工程菌株的構建方法，步驟如下：

⑴消除副產物檸檬酸的黑曲霉基因工程菌株的構建

步驟1，構建基因cexA敲除質粒：以野生型黑曲霉ATCC1015基因組為模板，通過PCR反應分別擴增獲得基因cexA的上游和下游同源重組序列片段；將所述基因cexA的上下游同源重組序列片段克隆到載體pLH594，構建基因cexA敲除質粒pLH623；

步驟2，cexA基因敲除菌株的獲得：將所述質粒pLH623轉化至宿主菌株S575，經轉化子篩選和潮霉素抗性基因重組獲得cexA基因敲除菌株S895；

⑵高效生產L-蘋果酸的黑曲霉基因工程菌株的構建