[發(fā)明專利]異檸檬酸脫氫酶激酶突變體及其在制備芳香族氨基酸中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010068018.0
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111286496B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張大偉;劉永飛
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/22;C12R1/19
• 代理公司: 天津市三利專利商標(biāo)代理有限公司 12107
• 代理人: 蘇宇歡

本發(fā)明公開了異檸檬酸脫氫酶激酶突變體及其在制備芳香族氨基酸中的應(yīng)用，異檸檬酸脫氫酶激酶突變基因aceK序列用SEQ ID No.1所示。本發(fā)明構(gòu)建的包含有大腸桿菌編碼異檸檬酸脫氫酶激酶突變基因aceK的工程菌生物安全，遺傳背景清晰，可以有效的提高大腸桿菌生產(chǎn)芳香族氨基酸的能力，苯丙氨酸和色氨酸的產(chǎn)量分別提高了12.1％和11.1％。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物技術(shù)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及一種大腸桿菌編碼的異檸檬酸脫氫酶激酶突變基因aceK及該基因編碼的氨基酸序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine)又名L-苯基-α-氨基丙酸，為白色結(jié)晶粉末，有苦味，熔點為283℃，在自然界中廣泛存在于卵、乳和動物蛋白中，其含量5為％～6％，在植物性蛋白質(zhì)中約含1％。苯丙氨酸可溶于水，在水中的溶解度為3％，難溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，在100耐水中的溶解度為51℃：4.4g，等電點為5.48。苯丙氨酸有外消旋DL-型，L-型和D-型，其中最重要的是L-苯丙氨酸。

苯丙氨酸是8種必須氨基酸之一，其作為營養(yǎng)物質(zhì)的同時也是體內(nèi)的生糖兼生酮氨基酸，在代謝中有著不可代替的作用。在工業(yè)上，L-苯丙氨酸主要用于與天冬氨酸反應(yīng)形成人工甜味劑阿斯巴甜。這種甜味劑在功能食品添加劑中有著廣泛的需求。在醫(yī)藥領(lǐng)域上，L-苯丙氨酸是靜脈輸液的必需物質(zhì)，同時可以用作許多抗腫瘤藥物靶向供給的載體。目前全球市場L-苯丙氨酸年需求量超過50000噸，并且逐年以15％的速率穩(wěn)定增長，其中阿斯巴甜的年需求量約為20000噸；另一方面，醫(yī)藥行業(yè)每年L-苯丙氨酸需求量約為8000噸。因此，L-苯丙氨酸具有巨大的市場開發(fā)空間(Liu X,Niu H,Li Q,et al.Metabolic engineeringfor the production of l-phenylalanine in Escherichia coli[J].3Biotech,2019,9(3).)。

苯丙氨酸的制備方法有發(fā)酵法、酶法與化學(xué)合成法。用化學(xué)合成法經(jīng)拆分可制得苯丙氨酸。化學(xué)合成法用苯甲醛和N-乙酞甘氨酸為原料，合成N-乙酞苯丙氨酸，再經(jīng)氨基酞化酶拆分得L-苯丙氨酸。用氯節(jié)和丙二酸二乙醋或乙酞氨基丙二酸二乙醋或乙酞氨基氮基乙酸乙醋為原料，經(jīng)氨基酞化酶水解制成L-苯丙氨酸和D-苯丙氨酸。國內(nèi)生產(chǎn)廠家主要采用發(fā)酵法。苯丙氨酸的合成途徑目前比較清晰，大腸桿菌利用自身的PTS系統(tǒng)將外源的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，同時將其磷酸化為六磷酸葡萄糖。磷酸化后的葡萄糖一部分通過糖酵解途徑(EMP)進(jìn)入三羧酸循環(huán)產(chǎn)生ATP為機(jī)體的生命活動提供能量和一些中間物質(zhì)(作為前體物為參與機(jī)體其他物質(zhì)的合成)，其中就包括磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，另一部分則進(jìn)入磷酸戊糖非氧化還原途徑(PP)產(chǎn)生赤蘚糖4-磷酸(E4P)，PEP和E4P經(jīng)過莽草酸途徑生成分支酸并最終生成苯丙氨酸。苯丙氨酸的生物合成受其自身的反饋抑制和反饋阻遏。苯丙氨酸的生產(chǎn)菌株的代謝工程改造策略主要包括以下幾部分內(nèi)容：1.增加前體PEP和E4P的供給；2.增強(qiáng)莽草酸途徑；3.降低其他芳香族氨基酸競爭途徑通量；4.解除反饋阻遏和反饋抑制；5.增強(qiáng)苯丙氨酸外排；6.敲除苯丙氨酸去路途徑。(Rodriguez A,Martínez,Juan A,Flores,Noemí,et al.EngineeringEscherichia colito overproduce aromatic aminoacids and derived compounds[J].Microbial Cell Factories,2014,13(1):126.)