[發(fā)明專利]一種維生素K環(huán)氧化物還原酶體外活性測定方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010067624.0
• 申請日: 2020-01-20
• 公開（公告）號: CN113136413B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發(fā)明（設計）人: 沈國民;高蒙;劉紅麗;沈滟;曹青;李三強
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26
• 代理公司: 鄭州睿信知識產(chǎn)權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種維生素K環(huán)氧化物還原酶體外活性測定方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)材料的準備：

分別配制緩沖液1、緩沖液2、緩沖液3和緩沖液4，儲存?zhèn)溆茫?/p>

緩沖液1的組成包括：pH值7.0-8.0的Tris-HCl 20-50mmol/L，NaCl 100-150mmol/L，LMNG或GDN 0.5-5g/L，溶劑為水；

緩沖液2的組成包括：GSH 0.4-1mol/L，溶劑為水；pH值7.0-7.6；

緩沖液3的組成包括：維生素K環(huán)氧化物1-50mmol/L，溶劑為異丙醇；

緩沖液4的組成包括：維生素K1-100mmol/L，溶劑為異丙醇；

2)工作液的配制：

分別取緩沖液1、緩沖液2和緩沖液3，配制GSH濃度為60-160mmol/L、維生素K環(huán)氧化物濃度為30-80μmol/L的維生素K環(huán)氧化物工作液；

分別取緩沖液1、緩沖液2和緩沖液4，配制GSH濃度為60-160mmol/L、維生素K濃度為30-80μmol/L的維生素K工作液；

分別取VKOR蛋白和緩沖液1，配制VKOR蛋白濃度為1-5μmol/L的VKOR蛋白工作液；

3)VKOR蛋白催化KO的活性測定：

分別取維生素K環(huán)氧化物工作液和VKOR蛋白工作液，混合后加入熒光測量容器中，用熒光檢測儀檢測熒光，設定激發(fā)光的波長為245-255nm、發(fā)射光的波長為420-440nm，用終點法計算熒光值的增加量代表VKOR蛋白催化KO的活性；

VKOR蛋白催化K的活性測定：

分別取維生素K工作液和VKOR蛋白工作液，混合后加入熒光測量容器中，用熒光檢測儀檢測熒光，設定激發(fā)光的波長為245-255nm、發(fā)射光的波長為420-440nm，用終點法計算熒光值的增加量代表VKOR蛋白催化K的活性。

2.根據(jù)權利要求1所述的維生素K環(huán)氧化物還原酶體外活性測定方法，其特征在于：步驟1)中，所述緩沖液2的組成還包括堿性pH值調(diào)節(jié)劑，堿性pH值調(diào)節(jié)劑的用量以調(diào)節(jié)緩沖液2的pH值至7.0-7.6為準。

3.根據(jù)權利要求1所述的維生素K環(huán)氧化物還原酶體外活性測定方法，其特征在于：步驟1)中，所述緩沖液1的組成為：pH值7.5的Tris-HCl 20mmol/L，NaCl 100mmol/L，LMNG 1g/L或GDN 0.5g/L，溶劑為水；

所述緩沖液2的組成為：GSH 0.5mol/L，堿性pH值調(diào)節(jié)劑適量，溶劑為水；pH值7.5；

所述緩沖液3的組成為：維生素K環(huán)氧化物1mmol/L，溶劑為異丙醇；

所述緩沖液4的組成為：維生素K1mmol/L，溶劑為異丙醇。

4.根據(jù)權利要求1所述的維生素K環(huán)氧化物還原酶體外活性測定方法，其特征在于：步驟2)中，所述VKOR蛋白為人VKOR蛋白。

5.根據(jù)權利要求3所述的維生素K環(huán)氧化物還原酶體外活性測定方法，其特征在于：步驟2)中，所述維生素K環(huán)氧化物工作液的配制方法為：取800μL緩沖液1、160μL緩沖液2和40μL緩沖液3，混合均勻后室溫下平衡1小時以上，得到1mL GSH濃度為80mmol/L、維生素K環(huán)氧化物濃度為40μmol/L的維生素K環(huán)氧化物工作液；

所述維生素K工作液的配制方法為：取800μL緩沖液1、160μL緩沖液2和40μL緩沖液4，混合均勻，得到1mL GSH濃度為80mmol/L、維生素K濃度為40μmol/L的維生素K工作液；

所述VKOR蛋白工作液的配制方法為：取VKOR蛋白，用緩沖液1稀釋至人VKOR蛋白濃度為3μmol/L，得到VKOR蛋白工作液。