[發(fā)明專利]一種靶向抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶的小分子化合物的篩選方法及應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010067610.9 | 申請日： | 2020-01-20 |
| 公開（公告）號： | CN111239385B | 公開（公告）日： | 2023-03-14 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 沈國民;劉浩;沈滟;劉紅麗;曹青;高蒙;李三強(qiáng) | 申請（專利權(quán)）人： | 河南科技大學(xué) |
| 主分類號： | G01N33/543 | 分類號： | G01N33/543;C12Q1/26;A61K31/277;A61K31/137;A61K31/433;A61K31/37;A61K31/17;A61K31/4422;A61K31/454;A61K31/136;A61K31/122;A61K31/352;A61P7/04 |
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| 地址： | 471003 河*** | 國省代碼： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 靶向 抑制 維生素 環(huán)氧化物 還原酶 分子 化合物 篩選 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種靶向抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶的小分子化合物的篩選方法，其特征在于：包括以下步驟：
1)篩選靶向抑制維生素K循環(huán)的小分子化合物
將待選小分子化合物加入到含有維生素K的雙報告基因細(xì)胞體系培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，篩選出靶向抑制維生素K循環(huán)的小分子化合物；
所述雙報告基因細(xì)胞體系中含有同時表達(dá)FIX-Gla-PC融合基因和報告基因的質(zhì)粒，所述FIX-Gla-PC融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
2)篩選特異性抑制VKOR蛋白活性的小分子化合物
對篩選出的靶向抑制維生素K循環(huán)的小分子化合物進(jìn)行VKOR蛋白活性抑制測定，篩選出特異性抑制VKOR蛋白活性的小分子化合物；
步驟2)中，VKOR蛋白活性抑制測定的方法如下：
將篩選出的靶向抑制維生素K循環(huán)的小分子化合物與維生素K環(huán)氧化物工作液、VKOR蛋白工作液混合加入熒光測量板中，用熒光檢測儀檢測熒光，設(shè)定激發(fā)光的波長為245-255nm、發(fā)射光的波長為420-440nm，用終點法計算熒光值的增加量代表VKOR蛋白的活性；和/或者，
將篩選出的靶向抑制維生素K循環(huán)的小分子化合物與維生素K工作液、VKOR蛋白工作液混合加入熒光測量板中，用熒光檢測儀檢測熒光，設(shè)定激發(fā)光的波長為245-255nm、發(fā)射光的波長為420-440nm，用終點法計算熒光值的增加量代表VKOR蛋白的活性；
所述維生素K環(huán)氧化物工作液的配制方法為：分別取緩沖液1、緩沖液2和緩沖液3，配制得到GSH濃度為60-160mmol/L、維生素K環(huán)氧化物濃度為30-80μmol/L的維生素K環(huán)氧化物工作液；
所述維生素K工作液的配制方法為：分別取緩沖液1、緩沖液2和緩沖液4，配制得到GSH濃度為60-160mmol/L、維生素K濃度為30-80μmol/L的維生素K工作液；
所述VKOR蛋白工作液的配制方法為：分別取VKOR蛋白和緩沖液1，配制得到VKOR蛋白濃度為1-5μmol/L的VKOR蛋白工作液；
緩沖液1的組成包括：pH值7.0-8.0的Tris-HCl 20-50mmol/L，NaCl 100-150mmol/L，LMNG或GDN 0.5-5g/L，溶劑為水；
緩沖液2的組成包括：GSH 0.4-1mol/L，溶劑為水；pH值7.0-7.6；
緩沖液3的組成包括：維生素K環(huán)氧化物1-50mmol/L，溶劑為異丙醇；
緩沖液4的組成包括：維生素K1-100mmol/L，溶劑為異丙醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶的小分子化合物的篩選方法，其特征在于：步驟1)中，所述雙報告基因細(xì)胞體系的宿主細(xì)胞為人胚腎細(xì)胞293Trex。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶的小分子化合物的篩選方法，其特征在于：步驟1)中，所述報告基因為甲蟲熒光素酶報告基因，甲蟲熒光素酶報告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶的小分子化合物的篩選方法，其特征在于：步驟1)中，所述同時表達(dá)FIX-Gla-PC融合基因和報告基因的質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶的小分子化合物的篩選方法，其特征在于：步驟1)中，所述雙報告基因細(xì)胞體系培養(yǎng)液中維生素K的濃度為1～20μmol/L。
6.據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶的小分子化合物的篩選方法，其特征在于：所述終點法計算熒光值的增加量為：用熒光檢測儀每隔一段時間檢測一次熒光，檢測總時長為1-2小時；VKOR蛋白的活性＝反應(yīng)1小時的熒光值FT1-反應(yīng)開始時的本底熒光值FT0。
7.一種如權(quán)利要求1-6中任一項所述的靶向抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶的小分子化合物的篩選方法篩選出的小分子化合物。
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