[發(fā)明專利]一組草莓果實(shí)qRT-PCR內(nèi)參基因及其引物和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010067127.0
• 申請(qǐng)日: 2020-01-20
• 公開（公告）號(hào): CN111118199B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳建清;劉悅瀅;宋娟娟;王騰云;張憶琳;陳清西
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12N15/11;G16B20/00;G16B30/00
• 代理公司: 廈門智慧呈睿知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 35222
• 代理人: 楊唯

本發(fā)明提供一組草莓果實(shí)qRT?PCR內(nèi)參基因及其引物和應(yīng)用，具體涉及9個(gè)可用于廣泛草莓品種花托發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)分析的新內(nèi)參基因，其中內(nèi)參基因組合RPT6A和RPN5A可作為最優(yōu)內(nèi)參組合用于廣泛草莓品種花托發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)分析。本發(fā)明基于基因組和轉(zhuǎn)錄組篩選出的9個(gè)新內(nèi)參在草莓花托發(fā)育過(guò)程中表達(dá)穩(wěn)定度優(yōu)于目前使用的內(nèi)參基因(26?18S rRNA,Actin和GAPDH)；從9個(gè)新內(nèi)參中開發(fā)了一對(duì)RPT6A和RPN5A內(nèi)參組合，用于草莓花托發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)均化效果最佳；9個(gè)新內(nèi)參及所開發(fā)的RPT6A和RPN5A內(nèi)參組合可應(yīng)用于廣泛草莓品種的花托發(fā)育過(guò)程的基因表達(dá)研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及9個(gè)可用于廣泛草莓品種花托發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)分析的新內(nèi)參基因，其中內(nèi)參基因組合RPT6A和RPN5A可作為最優(yōu)內(nèi)參組合用于廣泛草莓品種花托發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)分析。

背景技術(shù)

八倍體草莓(Fragaria ananassa,F.ananassa)是全球最重要的水果之一。由于二倍體森林草莓(Fragaria vesca,F.vesca)已完成基因組測(cè)序和易遺傳轉(zhuǎn)化性，因此被作為八倍體草莓和其他薔薇科果樹的模式植物。果實(shí)發(fā)育進(jìn)程分為果實(shí)膨大的早期階段和成熟階段。從植物學(xué)角度看，草莓果實(shí)由瘦果和膨大的花托(果肉)組成的聚合果。膨大花托變成草莓的肉質(zhì)部分，是草莓主要的食用部分。因此，果實(shí)特別是花托發(fā)育的調(diào)控機(jī)制是廣大植物學(xué)家們和育種工作者共同關(guān)心的一個(gè)問(wèn)題。在研究這一機(jī)制過(guò)程中，需要從廣泛而全面的分子層面進(jìn)行研究。基因表達(dá)定量分析是解決復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的主要突破口。由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Reverse transcription–quantitative real time PCR,RT-qPCR)的特異性、精確性和可重復(fù)性，其被作為分析基因表達(dá)的首要方法，精確的均化是獲得可靠的RT-qPCR結(jié)果的基礎(chǔ)。因此，這個(gè)方法需要穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因(Reference Genes，RGs)對(duì)靶基因進(jìn)行數(shù)據(jù)均化，未能使用合適的RGs可能導(dǎo)致真實(shí)的基因表達(dá)量出現(xiàn)偏差和低重復(fù)率。

由于看家基因(House Keeping Genes，HKGs)在細(xì)胞中的基礎(chǔ)作用和穩(wěn)定的表達(dá)水平,常被用于均化目的基因表達(dá)量的RGs。迄今為止，在草莓果實(shí)的RT-qPCR研究中，最常用的三個(gè)傳統(tǒng)HKGs是26-18SrRNA、Actin、GAPDH。然而，傳統(tǒng)的HKGs，包括這三個(gè)正在使用的草莓HKGs并沒(méi)有經(jīng)過(guò)系統(tǒng)驗(yàn)證其穩(wěn)定性，僅僅是基于它們?cè)谌魏螚l件下都有恒定的表達(dá)水平的假設(shè)，就被應(yīng)用于草莓果實(shí)的研究。越來(lái)越多的證據(jù)表明，在一定條件下,包括在不同的發(fā)育階段，傳統(tǒng)HKGs的穩(wěn)定性會(huì)有相當(dāng)大的波動(dòng)。例如，在發(fā)育過(guò)程中，傳統(tǒng)的HKGs在種子和花粉中出現(xiàn)了較高的變異系數(shù)CoV值(衡量基因表達(dá)穩(wěn)定性的指標(biāo)，CoV值越高表達(dá)越不穩(wěn)定)。因而，在所研究的實(shí)驗(yàn)體系中對(duì)RGs進(jìn)行合適的綜合評(píng)估是十分必要的。所以，研究人員開發(fā)了geNorm、BestKeeper、NormFinder和Delta CT等軟件，用于統(tǒng)計(jì)分析以篩選出表達(dá)最穩(wěn)定的RGs。在前人的研究中，已對(duì)草莓果實(shí)發(fā)育中的13個(gè)候選HKGs進(jìn)行了評(píng)估，并篩選出FaRIB413(26-18S rRNA)和FaACTIN作為最合適的RGs；但遺憾的是，這一結(jié)果局限于候選RGs的范圍和候選RGs選擇的合理化。

轉(zhuǎn)錄組分析廣泛應(yīng)用于植物中研究復(fù)雜的分子機(jī)制。RNA-seq作為一種全局性的評(píng)估技術(shù)，以其大數(shù)據(jù)集、高分辨率和敏感性的優(yōu)勢(shì)提供了一個(gè)極具代表性的樣品轉(zhuǎn)錄組快照。利用RNA-seq數(shù)據(jù)集來(lái)篩選在不同條件下穩(wěn)定表達(dá)的理想RGs，已成功應(yīng)用在擬南芥、水稻和大豆等幾種植物中。到目前為止，草莓果實(shí)發(fā)育的研究已產(chǎn)生的大量RNA-seq數(shù)據(jù)集，這為篩選果實(shí)發(fā)育過(guò)程的最理想RGs提供了豐富的資源。

現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題：

目前，草莓花托研究所用的內(nèi)參主要以26-18S rRNA,Actin和GAPDH，這三個(gè)傳統(tǒng)看家基因作為單內(nèi)參在花托發(fā)育過(guò)程中用于均化目標(biāo)基因表達(dá)量。

主要缺陷在于：