[發(fā)明專(zhuān)利]一種跨膜蛋白的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010063756.6
• 申請(qǐng)日: 2020-01-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111381045B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 練楊華;晏劍虹;張瑤
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種跨膜蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法為針對(duì)跨膜蛋白提取和制樣的組合檢測(cè)方法，包括：

用膜蛋白抽提試劑提取組織或細(xì)胞中的跨膜蛋白獲取膜蛋白提取物；

在4-37℃條件下對(duì)提取的膜蛋白提取物制樣并對(duì)樣品進(jìn)行western?blot檢測(cè)；

所述組織或細(xì)胞中的跨膜蛋白的提取方法為：

步驟1：取抽提試劑A加入干凈組織或細(xì)胞中，破碎細(xì)胞，獲取混合組分；

步驟2：差速離心混合組分獲取含有膜蛋白的粗組分；

步驟3：以抽提試劑B選擇性分離含有膜蛋白的粗組分，獲取組織中的跨膜蛋白；所述抽提試劑A由以下成分組成：0.32M?Sucrose，10mM?Tris，1mM?MgCl₂·6H₂O，120mM?KCl，5mMEDTA，10mM?NaF，調(diào)pH值至弱堿性；

所述抽提試劑B由以下成分組成：50mM?HEPES，150mM?NaCl，100mM?KCl，1mM?MgCl₂·6H₂O，10wt％甘油，2wt％TritonX-100，5mM?EDTA，2mM?EGTA，調(diào)pH值至弱堿性；

所述膜蛋白提取物制樣方法步驟包括：

S1.檢測(cè)膜蛋白提取物中蛋白濃度；

S2.根據(jù)步驟S1測(cè)定的蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，充分混合，濃度調(diào)整至4μg/μl，樣品備用；

S3.將步驟S2制備好的樣品靜置于4-37℃條件下；

S4.將步驟S3中的樣品在4℃，10000g的條件下離心5分鐘，留上清用于western?blot檢測(cè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種跨膜蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，所述跨膜蛋白為鈉鉀ATP酶通道蛋白、ATP結(jié)合盒式蛋白中的一種或兩種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種跨膜蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，所述差速離心的具體操作方法為：

(1)4℃，300g離心混合組分10分鐘，收集上清；沉淀使用膜蛋白抽提試劑A繼續(xù)勻漿8-12次，4℃，700g離心10分鐘，收集并合并上清；

(2)4℃，700g離心步驟(1)中所收集的上清10分鐘，收集上清液至一新的離心管中；

(3)4℃，14000g離心步驟(2)所獲上清液30分鐘，以沉淀細(xì)胞膜碎片；繼續(xù)4℃，14000g離心10秒，去除上清并保留沉淀。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種跨膜蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，所述選擇性分離含有膜蛋白的粗組分的具體操作方法為：加入抽提試劑B，渦旋2分鐘，然后冰浴10分鐘；渦旋過(guò)程中，渦旋操作依照啟動(dòng)5-12秒、停止5-12秒重復(fù)循環(huán)直至2分鐘結(jié)束。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種跨膜蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，所述抽提試劑A的pH值調(diào)節(jié)至7.4。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種跨膜蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，所述抽提試劑B的pH值調(diào)節(jié)至7.4。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種跨膜蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，使用抽提試劑A之前，向抽提試劑A中加入蛋白酶抑制劑PMSF和原釩酸鈉，所述PMSF和原釩酸鈉的終濃度均為1μM。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種跨膜蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，使用抽提試劑B之前，向抽提試劑B中加入蛋白酶抑制劑PMSF和原釩酸鈉，所述PMSF和原釩酸鈉的終濃度均為1μM。