[發明專利]一種檢測凋落物外切葡聚糖酶活性的方法

在審

• 申請號: 202010063065.6
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111705109A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 劉兵;李世杰;葛炎;李小麗;劉怡;孫輝
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34;G01N21/75;G01N21/31;G01N21/64
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

1.一種檢測凋落物外切葡聚糖酶活性的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)將培養緩沖液加入剪碎過篩后的待測凋落物，于離心過濾管離心得到酶濾液，將酶濾液進一步稀釋制成酶活待測液；

2)將步驟1)中制得的一部分酶活待測液進行加熱滅活，作為滅活酶液；

3)配制梯度濃度的MUB熒光標準物質溶液，采用多功能酶標儀進行熒光檢測；

4)酶標板的酶標孔中分別加入酶活待測液和滅活酶液，再分別加入含有4-MUB-β-D-纖維素二糖苷的熒光底物工作液進行反應，隨后加入終止液終止反應；

5)采用多功能酶標儀對步驟4)反應結果進行熒光檢測；

6)以MUB熒光標準物質溶液的梯度濃度和測定的對應吸光值A繪制出熒光標準曲線，得到標準曲線斜率b；

7)計算酶活待測液的稀釋因子；

8)計算酶活待測液的比酶活。

2.根據權利要求1所述的檢測凋落物外切葡聚糖酶活性的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)將待測凋落物剪碎過2mm篩，每個樣品稱取3個0.15g分別加入3個離心過濾管中，分別加入600μL pH4.5的培養緩沖液，在4℃下孵育60min后，4℃下16000×g離心30min得到酶濾液后并混合，用培養緩沖液調節體積至4mL，制得酶活待測液；

2)從步驟1)制備的酶活待測液吸取1mL，在避光條件下85℃加熱2h，冷卻至室溫，得到滅活酶液；

3)配制梯度濃度的MUB熒光標準物質溶液，采用多功能酶標儀進行熒光檢測；

4)在黑色酶標板上，將33.3μL酶活待測液加入樣品孔，將33.3μL滅活酶液加入陰性對照孔；再將600μM熒光底物工作液，即600μM 4-MUB-β-D-纖維素二糖苷溶液，按每孔66.7μL加入到所述樣品孔和陰性對照孔中；在避光22℃的條件下160rpm震蕩孵育反應30min后，迅速向所有樣品孔和陰性對照孔中加入100μL pH10-11的1M Tris終止液終止反應；

5)采用多功能酶標儀對步驟4)反應結果進行熒光檢測；

6)以MUB熒光標準物質溶液的梯度濃度和測定的對應吸光值A繪制出熒光標準曲線，得到標準曲線斜率b；

7)計算待測樣品的稀釋因子D＝(200μL*4mL)/(33.3μL*X)，200μL為100μL的反應液加100μL終止液體積，4mL為培養緩沖液調節混合酶濾液后的酶活待測液體積，33.3μL為100μL反應液中加入的酶活待測液體積，X為混合酶濾液的體積；

8)計算待測樣品的比酶活：(A_活-A_陰)*D/(b*t*m)，比酶活單位為pmol/min/g，A_活為樣品酶活反應液的吸光值，A_陰為樣品對應滅活酶液的吸光值，D為稀釋因子，b為標準曲線斜率，t為震蕩孵育時間15min，m為3個離心過濾管凋落物的干重，單位為g。

3.根據權利要求1或2所述的檢測凋落物外切葡聚糖酶活性的方法，其特征在于，步驟1)中所述培養緩沖液，其制備方法為：將6.05gTris、7.8g馬來酸、7.0g檸檬酸或7.65g一水檸檬酸、3.12g硼酸，和244mL 1M氫氧化鈉，用去離子水定容至500mL得到通用緩沖液原液，再將所述通用緩沖液原液用鹽酸調至pH 4.5，用去離子水定容至1000mL，滅菌后4℃貯存，作為培養緩沖液備用。

4.根據權利要求2所述的檢測凋落物外切葡聚糖酶活性的方法，其特征在于，步驟3)具體為：稱取8.8mg MUB溶入1mL乙二醇單甲醚中，再加入4mL無菌去離子水混合均勻，制成MUB母液；取20μL上步MUB母液用無菌去離子水稀釋體積至20mL作為校準液，其濃度為10μM，避光4℃保存一周內備用；取MUB校準液用無菌去離子水依次稀釋為1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB熒光標準物質溶液；在黑色酶標板上，依次加入100μL濃度為0μM，1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB熒光標準物質溶液，4次重復，再分別加入100μL pH10-11的1M Tris終止液后，采用多功能酶標儀進行熒光檢測。