[發(fā)明專利]靶向腫瘤細(xì)胞表面MUC1的新型嵌合抗原受體及MUC1嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010062409.1
• 申請(qǐng)日: 2020-01-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111234031B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顧海華;吳廣;李紅智;趙靈潔;秦雅倩;曹佳薇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N5/10;C12N15/867;C12N15/62
• 代理公司: 溫州金甌專利事務(wù)所(普通合伙) 33237
• 代理人: 林益建

1.一種靶向腫瘤細(xì)胞表面MUC1的新型嵌合抗原受體,其特征在于，所述的靶向腫瘤細(xì)胞表面抗原MUC1的新型嵌合抗原受體由位于胞外的結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面抗原MUC1的單鏈抗體scFv、跨膜區(qū)和位于胞內(nèi)的T細(xì)胞的活化基序所組成，構(gòu)建新型融合基因anti-MUC1-scFv-CD28-CD137/4-1BB-CD3ζ，所述的新型嵌合抗原受體的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一種權(quán)利要求1所述的靶向腫瘤細(xì)胞表面MUC1的新型嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）MUC1.28.BB.z CAR基因的設(shè)計(jì)、重組慢病毒真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定；

（2）新型抗MUC1CAR重組慢病毒的制備；

（3）新型MUC1.28.BB.z CAR-T細(xì)胞的制備。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靶向腫瘤細(xì)胞表面抗原MUC1的新型嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述的步驟（1）MUC1.28.BB.z CAR基因的設(shè)計(jì)、重組慢病毒真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定由以下步驟組成：

（A）MUC1.28.BB.z CAR融合基因的設(shè)計(jì)：融合基因結(jié)構(gòu)為EcoRI-Kozak 序列-Igκ信號(hào)肽-VL-linker-VH-CD8 hinge-CD28跨膜區(qū)-CD28胞內(nèi)區(qū)-CD137/4-1BB-CD3ζ-BamH I， 其中Igκ信號(hào)肽、CD8基因的hinge、CD28基因的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、CD137/4-1BB基因、CD3ζ 基因的序列均參考Genebank（NCBI），VL和VH為人源化MUC1抗體scFv中的可變區(qū)輕鏈和可變區(qū)重鏈序列部分；

（B）慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：MUC1.28.BB.zCAR融合基因DNA片段經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后插入PLVX-EF1a-IRES.ZsGreen慢病毒表達(dá)質(zhì)粒中，產(chǎn)生的PLVX-EF1a-anti-MUC1CAR.IRES.ZsGreen質(zhì)粒經(jīng)過(guò)EcoR I和BamH I雙酶切鑒定后， 經(jīng)測(cè)序確證。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靶向腫瘤細(xì)胞表面抗原MUC1的新型嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述的步驟（2）新型抗MUC1CAR重組慢病毒的制備由以下步驟組成：

（a）MUC1.28.BB.z CAR重組慢病毒的包裝：在10cm培養(yǎng)皿中鋪7X10⁶個(gè)293T17細(xì)胞，培養(yǎng)液用含有1%青霉素-鏈霉素和8%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜，16-24h后，10cm皿中293T17細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前提前2h換成6mL無(wú)青霉素-鏈霉素的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染時(shí)按照目的質(zhì)粒，包裝質(zhì)粒：包膜質(zhì)粒質(zhì)量比例為4：3：1，分別取重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒PLVX-EF1a-anti-MUC1 CAR.IRES.ZsGreen1、PsPAX2和PMD2G加入1.5mL離心管中，再加入轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺（PEI），質(zhì)粒：PEI=1：3，充分混勻后將上述混合物逐滴加入10cm皿中，37℃，5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)染后16小時(shí)換液，加入5 ml新鮮培養(yǎng)液；

（b）MUC1.28.BB.z CAR重組慢病毒的濃縮、純化：換液24h后， 收集第一次病毒上清液于50mL離心管中，加入5 ml新鮮培養(yǎng)液于被轉(zhuǎn)染的293T17細(xì)胞中， 3000rpm,10min低速離心病毒上清液以除去細(xì)胞碎片，再用0.45um低蛋白吸附濾膜過(guò)濾除去雜質(zhì)，存放于4℃，待進(jìn)行病毒濃縮， 24h后收集第二次病毒上清液進(jìn)行與上述同樣處理，將上述經(jīng)過(guò)初步處理的病毒液加入含有20%蔗糖溶液的超速離心管中，蔗糖：病毒液=1:4,82700g，4℃離心2h，棄上清，病毒沉淀塊用1/100病毒原液體積的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，然后將濃縮病毒液移至1.5mL離心管中，14000rpm離心1分鐘， 進(jìn)一步純化，吸取上清液即可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，或分裝儲(chǔ)存于-80 ℃保存；

（c）MUC1.28.BB.z CAR重組慢病毒的滴度測(cè)定：在24孔培養(yǎng)板每孔鋪7X10⁴個(gè)293T-17細(xì)胞，500uL培養(yǎng)液，共設(shè)置8個(gè)孔，1孔用做轉(zhuǎn)導(dǎo)前細(xì)胞計(jì)數(shù)，1孔用做未轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)照孔，其余6孔分別用作Vector和MUC1.28.BB.z CAR病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的倍比稀釋孔，細(xì)胞覆蓋率為30-40%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)后24h換液，轉(zhuǎn)導(dǎo)后72h熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)，選取綠色熒光蛋白GFP表達(dá)陽(yáng)性率介于5%-20%的稀釋倍數(shù)孔做流式檢測(cè)。