[發明專利]一種紋狀體類器官的制備方法和應用

有效

• 申請號: 202010062009.0
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN113136367B
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發明（設計）人: 王曉群;吳倩;時穎超;郭麗潔
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 高麗娜;張瑩

1.培養基在制備紋狀體類器官中的用途，所述培養基包括以下各項：

1)干細胞培養基：其由DMEM/F12基礎培養基，血清替代物(KSR)，IWR1，LDN，SB431542，非必須氨基酸，Glutamax和β巰基乙醇組成；

2)神經誘導培養基I：其由DMEM/F12基礎培養基，N2添加劑，IWR1，LDN，SB431542，非必須氨基酸和肝素組成；

3)神經誘導培養基II：其由DMEM/F12基礎培養基，N2添加劑，不含維生素A的B27添加劑，Purmorphamine，IWR1，非必須氨基酸和肝素組成；

4)神經分化培養基I：其由neurobasal基礎培養基，N2添加劑，含有維生素A的B27添加劑，cAMP，DAPT，Glutamax和非必須氨基酸組成；和

5)神經分化培養基II：其由neurobasal基礎培養基，N2添加劑，含有維生素A的B27添加劑，cAMP，Glutamax和非必須氨基酸組成，其中，

所述血清替代物占干細胞培養基體積的10-30 %；

所述IWR1的濃度為1-10 μM；

所述LDN的濃度為0.05-2 μM；

所述SB431542的濃度為1-15 μM；

所述N2添加劑占神經誘導培養基I/II或神經分化培養基I/II體積的1%；

所述不含維生素A的B27添加劑占神經誘導培養基II體積的2%；

所述含有維生素A的B27添加劑占神經分化培養基I和/或II體積的2%；

所述Purmorphamin的濃度為1-5 μM；

所述DAPT的濃度為5-15 μM；

所述cAMP，其濃度為5-15 μM；

所述非必須氨基酸的濃度為0.01-1 mM；

所述Glutamax的濃度為1-5 mM；

所述β巰基乙醇的濃度為0.01-1 mM；和

所述肝素的濃度為1-5 μg/ml。

2.權利要求1所述的用途，其中

所述血清替代物占干細胞培養基體積的20%；

所述IWR1的濃度為3 μM；

所述LDN的濃度為0.1 μM；

所述SB431542的濃度為10 μM；

所述N2添加劑占神經誘導培養基I/II或神經分化培養基I/II體積的1%；

所述不含維生素A的B27添加劑占神經誘導培養基II體積的2%；

所述含有維生素A的B27添加劑占神經分化培養基I和/或II體積的2%；

所述Purmorphamin的濃度為1.5 μM；

所述DAPT的濃度為10 μM；

所述cAMP，其濃度為10 μM；

所述非必須氨基酸的濃度為0.1 mM；

所述Glutamax的濃度為2 mM；

所述β巰基乙醇的濃度為0.1 mM；

所述肝素的濃度為2 μg/ml。

3.一種誘導干細胞分化成紋狀體類器官的方法，所述方法包括以下步驟：

1) 無血清的擬胚體樣神經球培養，得到擬胚體樣神經球；

2) 神經誘導培養；

3) 神經分化培養；

所述的干細胞為人源的胚胎干細胞HES-3細胞系；

其中，步驟1)使用權利要求1或2中任一項中所述的干細胞培養基，步驟2)依次使用權利要求1或2中任一項中所述的神經誘導培養基I和II，步驟3)依次使用權利要求1或2中任一項中所述的神經分化培養基I和II，

其中步驟1)包括以下各項：

a. 將干細胞消化成為單細胞，使用干細胞培養基重懸所述單細胞，得到干細胞懸液，

b. 再將重懸的干細胞懸液以2x10⁶個/ml接種至低吸附培養板中，每天更換1/2-2/3培養基進行培養，得到擬胚體樣神經球，

其中在步驟2)中，將培養基更換為所述神經誘導培養基I，隔天更換培養基，培養2-7天，之后將培養基更換為所述神經誘導培養基II，隔天更換培養基，培養8-20天，

其中在步驟3)中，在步驟2)結束后，將培養基更換為所述神經分化培養基I，隔兩天更換培養基，培養7-15天，之后將培養基更換為所述神經分化培養基II，培養10-30天，隔兩天更換培養基。