[發明專利]具有抗真菌和清除自由基活性的環色-絲-纈-纈-亮肽及制備方法

有效

• 申請號: 202010061041.7
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111018954B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 胡豐林;羅飛飛;何亞瓊;尉杰;趙鋮
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C07K7/64
• 分類號: C07K7/64;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C12P21/02;A61P31/10;A61P39/06;C12R1/645
• 代理公司: 合肥金安專利事務所(普通合伙企業) 34114
• 代理人: 金惠貞

1.具有抗真菌和清除自由基活性的環色-絲-纈-纈-亮肽，其特征在于：所述環色-絲-纈-纈-亮肽的結構式如下：

所述環色-絲-纈-纈-亮肽是由色氨酸、絲氨酸、纈氨酸、纈氨酸和亮氨酸，以酰胺鍵連接而成的十五元環狀五肽；

所述環色-絲-纈-纈-亮肽具有清除自由基活性和抗白色鏈珠菌活性；

對二苯基苦基苯肼自由基的半數清除濃度為：1.17mg/mL，在200 μg /mL的濃度下對白色鏈珠菌的抑菌圈直徑為14.62mm。

2.權利要求1所述具有抗真菌和清除自由基活性的環色-絲-纈-纈-亮肽的制備方法，其特征在于操作步驟如下：

（1）菌種培養

將蛙糞霉（Basidiobolussp.）經過斜面菌種培養、二級液體種子培養、三級液體種子培養和四級培養，得到液體的最終發酵物或固體的最終發酵物；

所述蛙糞霉（Basidiobolussp.）為蛙生蛙糞霉、固孢蛙糞霉或裂孢蛙糞霉中的一種；

具體菌種培養操作如下：

（1.1）斜面種子培養

將蛙糞霉菌株接種于土豆瓊脂斜面培養基，于25～36℃恒溫、培養4～8d，得到一級菌種；

（1.2）二級液體種子培養

將一級菌種接種至液體搖瓶培養基培養；

在大于等于100 ml三角瓶中加入30～50%三角瓶體積的液體培養基，每個三角瓶接種1～3支斜面菌種，在全溫振蕩培養箱中，溫度25～36℃、轉速150～250 rpm條件下，培養3～7d，即得到二級菌種；

液體搖瓶培養基由葡萄糖25.0～50.0 g/L、麥芽提取物10.0～30.0 g/L、蛋白胨2.0～6.0 g/L、酵母浸出粉1.0～4.0 g/L、氯化鉀0.3～2.0 g/L、七水硫酸鎂0.3～2.0 g/L、磷酸二氫鉀0.3～2.0 g/L制成；

（1.3）三級液體種子培養

將二級菌種接種到大于等于5L的發酵罐，裝液量為罐體積的50～80%，接種量3～10%，在通氣量按體積比1:1～2（v/v）、壓力0.1～0.2MP、25～36℃條件下，恒溫通氣培養2～5天，得到三級菌種；

發酵罐中的培養基同步驟（1.2）中的液體培養基；

（1.4）四級培養

四級培養為液體培養，將三級菌種接種到大于等于50L的發酵罐，裝液量為罐體積的50～80%，接種量3～10%，在通氣量按體積比1:1～2（v/v）、壓力0.1～0.2MP、25～36℃條件下，恒溫通氣培養5～15天，得到液體的最終發酵物；發酵罐中的培養基同步驟（1.2）中的液體培養基；

（2）最終發酵物中有效成分的提取和精制

用甲醇或乙醇提取最終發酵物中的有效成分，采用反相色譜方法純化，得到白色粉末狀的環色-絲-纈-纈-亮肽；

具體操作如下：

（2.1）最終發酵物的預處理

將液體的最終發酵物經0.20～1.0μm濾膜過濾或2000-12000轉/分鐘條件下離心得到菌絲體；將菌絲體冷凍干燥，粉碎，過20～120目篩得到預處理物；

或，將固體的最終發酵物在30～130℃干燥到含水率小于等于20%，然后粉碎過20～120目得到預處理物；

（2.2）預處理物中有效成分的提取和分離純化

（2.2.1）提取

將預處理物，用甲醇或乙醇提取；料液比為1:2～20（W:V）、超聲波功率10～100KHz,提取時間為10～200分鐘；在轉速大于等于2000轉/分鐘條件下離心，或0.20～1.0μm濾膜過濾；取離心上清或濾液，在溫度小于等于100℃濃縮到原體積的1/2～1/10，得到濃縮脫醇液，同時回收甲醇或乙醇，濃縮脫醇液用于進一步的色譜法精制；

（2.2.2）分離純化

采用反相色譜方法純化，固定相為鍵合相填料，所述鍵合相填料為反相碳十八填料即RPC18，顆粒直徑為3～50微米；用甲醇和水按0～100：100～0配比進行梯度洗脫，收集質譜檢測器上分子量為676達爾頓（Dalton）的色譜流份；將收集物在小于等于100℃溫度以下濃縮到粘稠狀，在低于170℃條件下干燥；得到白色粉末狀的環色-絲-纈-纈-亮肽。

3.根據權利要求2所述制備方法，其特征在于：所述步驟（1.4）中，四級培養或為固體培養，將三級液體菌種拌入固體培養基中，接種量為固體料量的3～10%， 25～36℃恒溫培養5～15天，得到固體的最終發酵物；所述固體培養基由葡萄糖25.0～50.0 g/L、麥芽提取物10.0～30.0 g/L、蛋白胨2.0～6.0 g/L、酵母浸出粉1.0～4.0 g/L、氯化鉀0.3～2.0 g/L、七水硫酸鎂0.3～2.0 g/L、磷酸二氫鉀0.3～2.0 g/L、瓊脂15.0～30.0 g/L和水混合均勻制成。