[發明專利]重組釀酒酵母菌及其構建方法以及生產羥基脂肪酸的應用

在審

• 申請號: 202010060712.8
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111118052A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 盧文玉;李冰;劉靜靜;張傳波
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/90;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/62;C12N1/19;C12P7/42;C12R1/865
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 程小艷

本發明公開了一種重組釀酒酵母菌及其構建方法以及生產羥基脂肪酸的應用。通過同源重組的方法，將釀酒酵母中脂肪酸分解代謝相關的β氧化途徑中的關鍵基因酰基輔酶A氧化酶POX1敲除，再敲除酰基輔酶A活化酶FAA1和FAA4，得到重組菌(一)，再向重組菌(一)中導入細胞色素P450氧化酶CYP52M1和細胞色素P450還原酶SbCPR，得到重組菌株(二)，或者向重組菌(一)中導入細胞色素P450氧化酶CYP52M1和細胞色素P450還原酶AtCPR1，得到重組菌(三)，或向重組菌(一)中導入細胞色素P450氧化酶和細胞色素P450還原酶融合蛋白基因CYP52M1?AtCPR1，得到重組菌(四)。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及重組釀酒酵母菌及其構建方法以及生產羥基脂肪酸的應用。

背景技術

羥基脂肪酸是一類具有羧基和羥基的小分子化合物，與脂肪酸相比具有更好的反應活性、穩定性和粘度。由于其獨特的性質，長鏈羥基脂肪酸廣泛用于各種領域，如食品、化學、化妝品工業，以及作為神經酰胺、聚酯和環內酯的合成中間體。羥基脂肪酸的藥物屬性，包括抗生物，抗炎和抗糖尿病作用也被揭示。特別是，羥基脂肪酸分子中羥基的不同位置對生理性質和化學工業起著至關重要的影響作用。靠近羧基發生的羥基化可產生α-或β-羥基化，這種結構對于人類健康有著重大影響^[9]。ω-羥基脂肪酸是末端帶有羥基的脂肪酸，是具有廣泛應用的多功能化合物，如粘合劑、潤滑劑和潛在的抗癌劑，并作為材料用于生物塑料等聚合物的合成，生產的生物塑料具有更好的耐水性、無毒性、生物相容性和化學多功能性。

鑒于羥基脂肪酸具有廣泛的商業用途，研究者們進行了大量努力通過化學或生物學的方法生產羥基脂肪酸。由于選擇性碳原子的限制和苛刻的反應條件，通過化學催化直接合成所需的特定的羥基脂肪酸分子是難以實現的。在生物系統中，可以利用酵母或者大腸桿菌，通過選擇性酶促反應實現脂肪酸分子的特定羥基化反應來實現羥基脂肪酸的合成。例如，巨大芽孢桿菌可以在1,2和3個碳原子位置處羥基化油酸分子，產生不同的羥基油酸。在烷烴或脂肪酸作為主要碳源培養時，熱帶假絲酵母也可產生羥基脂肪酸作為副產物。

釀酒酵母是一種傳統且經過充分研究的宿主菌株，具有成熟的用于代謝途徑操作的遺傳工具，并已被成功操作以生產許多有價值的平臺化學品和生物燃料。此外，釀酒酵母易于在化學成分確定的培養基中培養，并且可以利用廉價的可再生原料并顯示出快速的生長速率，這有利于更廣泛的工業應用。釀酒酵母內源的脂肪酸合成途徑可以為羥基脂肪酸的合成提供前體，其后的羥基化反應通過后續導入的細胞色素P450氧化酶CYP52M1和還原酶CPR來完成。基于以上釀酒酵母內源途徑和羥基脂肪酸外源合成基因的發掘，利用合成生物學的方法和技術，在釀酒酵母構建和優化羥基脂肪酸的生物合成途徑來生產羥基脂肪酸具有很大的潛力。

目前，利用合成生物學方法在釀酒酵母中異源合成特定結構(C16-C18)的ω(ω-1)-羥基脂肪酸還未見報道。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種重組釀酒酵母菌及其構建方法以及生產羥基脂肪酸的應用。

本發明的第二個目的是提供一種生產羥基脂肪酸的重組釀酒酵母菌(一)的構建方法。

本發明的第三個目的是提供一種生產羥基脂肪酸的重組釀酒酵母菌(二)。

本發明的第四個目的是提供一種生產羥基脂肪酸的重組釀酒酵母菌(二)的構建方法。

本發明的第五個目的是提供一種生產羥基脂肪酸的重組釀酒酵母菌(三)。

本發明的第六個目的是提供一種生產羥基脂肪酸的重組釀酒酵母菌(三)的構建方法。

本發明的第七個目的是提供一種生產羥基脂肪酸的重組釀酒酵母菌(四)。

本發明的第八個目的是提供一種生產羥基脂肪酸的重組釀酒酵母菌(四)的構建方法。