[發明專利]一種表觀遺傳的DAP-seq測序建庫方法

有效

• 申請號: 202010060460.9
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111155175B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 周煌凱;夏昊強;高川;艾鵬;陳飛欽;張東東;張秋雪
• 申請（專利權）人: 廣州基迪奧生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N15/70
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥

1.一種表觀遺傳的DAP-seq測序建庫方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、構建基因表達載體；

S2、TF體外表達預實驗；

S3、DAP-seq建庫；步驟S1的具體操作如下：

(1)根據TF家族的基因序列，設計合成相關基因的引物，得TF引物；

(2)用步驟S1獲得的TF引物，通過PCR擴增TF基因；

(3)利用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，跑膠鑒定目的條帶，回收含目標條帶的瓊脂糖凝膠，得含目標條帶的PCR產物；

(4)將步驟(3)所得含目標條帶的PCR產物，用infusion連接方法，以pFN19K T7SP6Vector作為載體，進行載體連接；

(5)取出感受態細胞于冰上解凍，得感受態細胞懸液；

(6)向步驟(5)所得感受態細胞懸液中加入5μL的infusion連接產物及連接好的載體，于42℃熱激60s，然后冰浴2min；

(7)向每個離心管中加入液體培養基，37℃復蘇DH5α大腸桿菌化學感受態細胞，然后于室溫，6000rpm的條件下離心5min，去掉上清液，得重懸細菌；

(8)將步驟(7)所得重懸細菌均勻涂在LB+Kan(卡那霉素)固體培養基上，干燥后，倒置平板，37℃過夜培養；

(9)挑選單克隆菌，并分別接菌于LB+Kan(卡那霉素)液體培養基中，37℃搖菌，至肉眼可見的渾濁；

(10)鑒定陽性克隆菌，并通過1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶，挑選出陽性單克隆菌；

(11)將步驟(10)挑選出的陽性單克隆菌接種于液體培養基中，37℃過夜培養，然后通過提取構建好的目的TF的重組表達質粒，進行PCR鑒定并測序，挑選出與目標序列一致的單克隆菌，即得；步驟(4)中的pFN19K T7 SP6 Vector質粒是用致死基因ccdb替換了原有的致死基因barnase，同時在ccdb兩端引入Hind III和EcoR V兩個酶切位點，改進獲得的；

步驟S3的具體操作過程為：

(1)將DNA用超聲打斷，然后用磁珠分選DNA片段，得分選后的DNA片段；

(2)在步驟(1)所得分選后的DNA片段末端修復加A，同時加接頭，得構建好的DNA文庫；

(3)體外表達帶有halo tag的目的蛋白，然后將該蛋白與磁珠結合，于25℃的條件下金屬浴2h，得產物I；

(4)將步驟(3)所得產物I與步驟(2)所得構建好的DNA文庫混合，于25℃的條件下振蕩1h，洗滌磁珠，洗脫樣本，得洗脫液；

(5)將步驟(4)所得洗脫液進行PCR反應，獲得PCR產物，用磁珠純化，即可；步驟(2)中的A指腺嘌呤，接頭是短核苷酸序列，接頭1的序列信息如SEQ ID NO.1所示；接頭2的序列信息如SEQ ID NO.2所示；步驟(7)，步驟(9)及步驟(11)中的液體培養基為LB液體培養基；步驟(8)中的固體培養基為LB固體培養基；步驟S2的具體操作過程如下：

(1)配制5μL的反應體系，25℃金屬浴2h；

(2)制備page膠，每個孔加1μL樣品，進行電泳；

(3)用甲醇提前預處理8.5cm×4.0cm的PVDF膜，備用；

(4)將電泳完畢的凝膠去除濃縮膠后，放入8.5cm×4.0cm的PVDF膜，膜轉移buffer中，平衡5min；

(5)在膠黑膜白的前提下，放入轉膜槽中轉膜；

(6)小心將PVDF膜取出，正面朝上，加入適量封閉液；

(7)一抗溶于封閉液，混勻后，加在8.5cm×4.0cm的PVDF膜上，孵育60min；

(8)二抗溶于封閉液，混勻后，加在8.5cm×4.0cm的PVDF膜上，孵育60min；

(9)將PVDF膜正面朝上，加入1mL的Thermo Scientific SuperSignal West PicoPLUSChemiluminescent Substrate作為熒光底物，于25℃的條件下反應2min，然后將PVDF膜放入暗盒，加入顯影膠片；

(10)在暗室中曝光、顯影、定影，將底片在自來水下沖洗干凈后，烘干，保存，分析結果，若TF能正常體外表達，即可；步驟(1)中的5μL的反應體系包括：3μL的 SP6 High-YieldWheat Germ Master Mix和2μL的目的質粒；

步驟(7)中的一抗指Anti-HaloTag MonoClonal antibody，步驟(8)中的二抗指GoatAnti-Mouse IgG(H+L)HRP Conjugate。