[發明專利]基于CRISPR-Cas12a系統的可視化快速核酸檢測方法及應用

有效

• 申請號: 202010060317.X
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111235232B
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 謝勝松;趙書紅;李新云;劉向東;陶大剛;劉佳佳;徐兵榮;聶雄偉
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 徐迅;崔佳佳

1.一種用于檢測靶標核酸分子的熒光或裸眼可視化檢測體系，其特征在于，所述檢測體系包括：

(a)Cas12a蛋白，所述Cas12a蛋白是Cas12a或者具有與Cas12a的旁路單鏈DNA切割活性類似的Cas蛋白；

(b)sgRNA，所述sgRNA引導Cas12a蛋白特異性結合于靶標核酸分子；和

(c)核酸探針，所述核酸探針含有可檢測的標記物，其中當所述核酸探針被Cas12a蛋白旁路切割后，產生可檢測信號；

其中，所述的可檢測信號包括熒光信號，或不需要儀器而直接裸眼可見的信號；

其中，所述的可檢測的標記物為熒光團；

并且所述的核酸探針是ssDNA-報告分子即ssDNA-reporter，并且在所述報告分子的堿基進行修飾為：在5'端標記熒光基團JOE或ROX；和在3'端標記淬滅基團BHQ1或BHQ2；

并且所述的核酸探針是單鏈DNA；

其中，所述的核酸探針的結構為5'JOE-N₁₂-3'BHQ1、5'ROX-N₁₂-3'BHQ1或5'ROX-N₁₂-3'BHQ2，其中，N代表選自A、T、C、G的任一堿基，5'JOE表示位于5'的JOE，5'ROX表示位于5'的ROX，而3'BHQ1表示位于3'端的BHQ1，3'BHQ2表示位于3'端的BHQ2；并且，所述N₁₂的序列為GTATCCAGTGCG；

其中，當所述體系中不存在靶標核酸分子時，則所述核酸探針不被Cas12a蛋白旁路切割；而當所述體系中存在靶標核酸分子時，則所述核酸探針被Cas12a蛋白旁路切割；

其中“裸眼可視化”是指如果觀察熒光信號，需借助熒光檢測設備進行檢測；而如果是觀察溶液的顏色發生改變，則不需要儀器而直接裸眼可視化檢測。

2.如權利要求1所述的可視化檢測體系，其特征在于，所述核酸探針的一端帶有標記熒光基團JOE，而另一端帶有淬滅基團BHQ1。

3.如權利要求1所述的可視化檢測體系，其特征在于，所述的檢測體系中，ssDNA-報告分子的濃度為2-200 μM。

4.如權利要求1所述的可視化檢測體系，其特征在于，所述的檢測體系中，ssDNA-報告分子的濃度為4-100 μM。

5.如權利要求1所述的可視化檢測體系，其特征在于，所述的檢測體系中，ssDNA-報告分子的濃度為5-50 μM。

6.如權利要求1所述的可視化檢測體系，其特征在于，所述的檢測體系還含有(d)緩沖液。

7.如權利要求1所述的可視化檢測體系，其特征在于，所述的檢測體系還含特異的核酸擴增引物對。

8.如權利要求1所述的可視化檢測體系，其特征在于，所述的檢測體系還含有待檢測的靶標核酸分子。

9.如權利要求6所述的可視化檢測體系，其特征在于，所述的檢測體系還含有：

(e1)用于擴增靶標DNA的聚合酶；

(e2)用于擴增靶標DNA的等溫擴增酶；

(e3)任選的用于反轉錄的反轉錄酶；

(e4)用于擴增反應和/或反轉錄反應的dNTP。

10.如權利要求1所述的可視化檢測體系，其特征在于，所述的ssDNA-reporter的堿基進行的修飾為在3'端標記淬滅基團BHQ2。

11.如權利要求3所述的可視化檢測體系，其特征在于，所述的檢測體系中，5'JOE-N₁₂-3'BHQ2被作為熒光或裸眼可視化的報告分子使用時，濃度為2-200 μM。

12.如權利要求1所述的可視化檢測體系，其特征在于，所述靶標核酸分子包括來源于選自下組的靶標核酸分子：植物、動物、昆蟲、微生物、病毒、或其組合。