[發(fā)明專利]基于CRISPRi調(diào)控的利用谷氨酸棒狀桿菌合成乙醛酸的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010060152.6 | 申請日： | 2020-01-19 |
| 公開（公告）號： | CN113136382B | 公開（公告）日： | 2023-01-31 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 馮惠勇;李天明;王麗麗 | 申請（專利權(quán)）人： | 河北科技大學 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;C12N15/77;C12N15/66;C12P7/40;C12R1/15 |
| 代理公司： | 石家莊旭昌知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 13126 | 代理人： | 宋會然 |
| 地址： | 050000 河*** | 國省代碼： | 河北;13 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 基于 crispri 調(diào)控 利用 谷氨酸 桿菌 合成 乙醛酸 方法 | ||
1.一種基于CRISPRi調(diào)控的利用谷氨酸棒狀桿菌合成乙醛酸的方法，其特征在于：該方法包括通過dCas9表達盒基因置換谷氨酸棒狀桿菌的乙醛脫氫酶編碼基因，通過異檸檬酸脫氫酶編碼基因與蘋果酸合成酶編碼基因的sgRNA轉(zhuǎn)錄單元置換谷氨酸棒狀桿菌的乳酸脫氫酶編碼基因，并過表達谷氨酸棒狀桿菌的異檸檬酸裂合酶編碼基因，得到谷氨酸棒狀桿菌工程菌株，且培養(yǎng)所述工程菌株發(fā)酵合成乙醛酸；
其中，所述dCas9表達盒基因的序列如SEQ ID NO:1所示；
所述蘋果酸合成酶編碼基因的序列如SEQ ID NO:2所示；
所述異檸檬酸脫氫酶編碼基因的序列如SEQ ID NO:3所示；
所述乙醛脫氫酶編碼基因的序列如SEQ ID NO:4所示；
所述乳酸脫氫酶編碼基因的序列如SEQ ID NO:5所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CRISPRi調(diào)控的利用谷氨酸棒狀桿菌合成乙醛酸的方法，其特征在于：所述dCas9表達盒基因置換乙醛脫氫酶編碼基因包括構(gòu)建dCas9表達盒基因打靶質(zhì)粒，將所述dCas9表達盒基因打靶質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入野生型谷氨酸棒狀桿菌菌株，通過兩次同源重組，使dCas9表達盒基因置換乙醛脫氫酶編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于CRISPRi調(diào)控的利用谷氨酸棒狀桿菌合成乙醛酸的方法，其特征在于：所述dCas9表達盒基因打靶質(zhì)粒的構(gòu)建包括：
a1.以谷氨酸棒狀桿菌基因組為模板，擴增出乙醛脫氫酶編碼基因的上、下同源臂片段，啟動子posd基因片段；
a2.以dCas9-Peasy質(zhì)粒為模板，擴增出dCas9基因片段；
a3.通過融合PCR技術(shù)將a1和a2步驟擴增的基因片段搭接；
a4.將a3步驟獲得的搭接片段與空質(zhì)粒pK18mobsacB用Nhe I和Xho I進行雙酶切，得到的酶切產(chǎn)物純化，經(jīng)T4連接酶于16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化至E.coli TransT1感受態(tài)細胞中，經(jīng)驗證篩選,獲得打靶質(zhì)粒dCas9-pK18mobsacB。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于CRISPRi調(diào)控的利用谷氨酸棒狀桿菌合成乙醛酸的方法，其特征在于：所述異檸檬酸脫氫酶編碼基因與蘋果酸合成酶編碼基因的sgRNA轉(zhuǎn)錄單元置換乳酸脫氫酶編碼基因包括構(gòu)建異檸檬酸脫氫酶編碼基因與蘋果酸合成酶編碼基因的sgRNA轉(zhuǎn)錄單元打靶質(zhì)粒，將該sgRNA轉(zhuǎn)錄單元打靶質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入已由dCas9表達盒基因置換乙醛脫氫酶編碼基因的谷氨酸棒狀桿菌菌株，通過兩次同源重組，使異檸檬酸脫氫酶編碼基因與蘋果酸合成酶編碼基因的sgRNA轉(zhuǎn)錄單元置換乳酸脫氫酶編碼基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于CRISPRi調(diào)控的利用谷氨酸棒狀桿菌合成乙醛酸的方法，其特征在于：所述異檸檬酸脫氫酶編碼基因與蘋果酸合成酶編碼基因的sgRNA轉(zhuǎn)錄單元打靶質(zhì)粒的構(gòu)建包括：
b1.以谷氨酸棒狀桿菌基因組為模板，擴增出乳酸脫氫酶編碼基因的上、下同源臂片段；
b2.利用融合PCR擴增出異檸檬酸脫氫酶編碼基因的sgRNA轉(zhuǎn)錄單元組件，以及蘋果酸合成酶編碼基因的sgRNA轉(zhuǎn)錄單元組件，其中，異檸檬酸脫氫酶編碼基因的sgRNA轉(zhuǎn)錄單元組件包括啟動子psod基因序列、20bp的sgRNA基因序列、Cas9蛋白結(jié)合區(qū)域基因序列以及終止子rrnB基因序列，蘋果酸合成酶編碼基因的sgRNA轉(zhuǎn)錄單元組件包括啟動子ptuf基因序列、20bp的sgRNA基因序列、Cas9蛋白結(jié)合區(qū)域基因序列以及終止子rrnB基因序列；
b3.利用b1步驟的上、下同源臂片段與b2步驟的異檸檬酸脫氫酶編碼基因和蘋果酸合成酶編碼基因的sgRNA組件，通過Golden Gate克隆法構(gòu)建出異檸檬酸脫氫酶編碼基因與蘋果酸合成酶編碼基因的sgRNA轉(zhuǎn)錄單元打靶質(zhì)粒。
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