[發明專利]一種宏基因組樣本去宿主化提取試劑盒的使用方法在審
| 申請號： | 202010059725.3 | 申請日： | 2020-01-19 |
| 公開（公告）號： | CN111088249A | 公開（公告）日： | 2020-05-01 |
| 發明（設計）人： | 劉淑君;王春香 | 申請（專利權）人： | 泰州健為醫學檢驗實驗有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 南京常青藤知識產權代理有限公司 32286 | 代理人： | 黃胡生 |
| 地址： | 225300 江蘇省泰州市中國醫藥*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 宏基 樣本 宿主 提取 試劑盒 使用方法 | ||
1.一種宏基因組樣本去宿主化提取試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟：
S1.病原體富集：在1.5mL第一離心管中加入樣本，于室溫條件下離心5-10min，除去上清液；
S2.宿主細胞裂解：在第一離心管中加入200-1000μL裂解緩沖液Buffer G1，在20-40℃條件下孵育10-30min；
S3.宿主DNA去除：第一離心管于室溫條件下離心2-5min，除去上清液，向第一離心管中再次加入200-500μL裂解緩沖液Buffer G1和1-3μL全能核酸酶，30-40℃孵育10-30min，10000-12000rpm離心2-5min，除去上清液，加入500-1000μL Buffer G1清洗沉淀，10000-12000rpm離心2-5min，除去上清液，重復清洗步驟一次；
S4.微生物菌體破壁：加入100-300μL溶菌酶重懸沉淀后將重懸液轉移到裝有玻璃珠的裂解管中，將裂解管置于30-40℃孵育10-30min，渦旋混勻處理5-10min；
S5.微生物裂解和核酸提取：將樣品瞬時離心后加入10-40μL蛋白酶K和200-500μL裂解緩沖液Buffer GL，渦旋混勻后于50-65℃孵育10-30min，12000rpm離心1min，吸取上清至第二離心管中，向第二離心管中加入200μL無水乙醇，渦旋混勻后將溶液加入到已裝入收集管的吸附柱中，12000rpm離心1min，除去收集管中的液體，將吸附柱重新放回至該收集管中，向吸附柱中加入500μL清洗液Buffer GW1，12000rpm離心1min，除去收集管中的液體，將吸附柱重新放回至該收集管中，向吸附柱中加入500μL清洗液Buffer GW2，12000rpm離心1min，除去收集管中的液體，將吸附柱重新放回至該收集管中，12000rpm離心2min后，除去收集管中的液體，將吸附柱置于室溫條件下徹底晾干后放入第三離心管中，向吸附柱中加入50μL Buffer GE，室溫放置5min，12000rpm離心1min，收集DNA溶液于-20℃條件下保存。
2.根據權利要求1所述的宏基因組樣本去宿主化提取試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟S2中裂解緩沖液Buffer G1包括5mM Tris-HCl、3mM MgCl2，1％Triton X-100，1％(w/v)SDS，10mM DTT和10mM HEPS-KOH，裂解緩沖液Buffer G1的pH值為8.0。
3.根據權利要求2所述的宏基因組樣本去宿主化提取試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟S3中的全能核酸酶的濃度為200-250U/μL。
4.根據權利要求3所述的宏基因組樣本去宿主化提取試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟S4中裂解管置于30-40℃孵育10-30min后，可于恒溫混勻儀上2500-2900rpm處理5-10min。
5.根據權利要求4所述的宏基因組樣本去宿主化提取試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟S5中裂解緩沖液Buffer GL包含Tris-HCl、氯化鈉、異硫氰酸胍、SDS和TritonX-100。
6.根據權利要求5所述的宏基因組樣本去宿主化提取試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟S5中樣品與蛋白酶K的體積比為5：1-20：1，蛋白酶K的酶活濃度范圍為10mg/mL-30mg/mL。
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